Au cours de la croissance bactérienne IL y a une phase de latence, une phase exponentielle et une phase stationnaire








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date de publication27.03.2017
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la régulation chez les procaryotes

introduction





Au cours de la croissance bactérienne il y a une phase de latence, une phase exponentielle et une phase stationnaire.
Les gènes s’expriment différemment selon ces phases.

La carence nutritionnelle éteint l’expression des gènes de phase exponentielle et allume l’expression des gènes de phase stationnaire. Il existe différents stress : Déshydratation, Salinité, pH, Oxydatif, Variation température, de pH, stress oxydatif…

Les bactéries pathogènes sont dégradées par les macrophages avec H2O2 alors que bactéries de estomac ne sont pas dégradées par le pH acide.

Les bactéries doivent réagir au contrainte de l’environnement donc le stress est perçu immédiatement. L’adaptation va être rapide ! Elles peuvent s’adapter si le stress n’est pas trop fort, sinon il y va y avoir mort cellulaire.

la transcription/traduction chez les procaryotes




l’unité de transcription



la transcription et la traduction sont simultanées = colinéarité

stabilité/dégradation d’ARNm


Il y aune colinéarité transcription/traduction chez bactéries car on va avoir une protection de l’ARN naissant car il n’y a pas de noyau donc les ribosomes se fixe directement sur l’ARNm naissant. Cela protège de l’attaque par l’ARNase. Les transcrits sont très instable car il n’y a pas de coiffe 5’P ni de queue PolyA en 3’. En 5’ il y a un nucléotide tri-phosphate car il n’est pas engagé dans une liaison.

La dégradation est très rapide sans ribosomes, au bout de 1min30 s’il n’y a pas de liaison des ribosomes  dégradation.

gène


Fixation sur RBS


Le RBS ou SD est le site de fixation aux ribosomes, il se situe à 5-8 pb de l’ATG initial.

Ribosome : 50S et 30S.

Le positionnement du ribosome se fait via la sous unité 30s (petite sous unité) grâce a la petite sous unité 16s car elle est complémentaire de SD.

Selon les situations le site de fixation des ribosomes peut ne pas être accessible. On utilise donc différentes technique….

Régulation de la traduction au niveau ribosomal


Le ribosome ne peut pas se lier lorsque l’ARNm a cette conformation.

Un autre ARNm peut changer la conformation de cet ARN.

La transcription se divise en 4 étapes :

  1. Reconnaissance matrice

  2. Initiation (ARN pol + promoteur) fusion ADN DS et donne bulle ADN SS

Le complexe fermé devient ouvert.

  1. Élongation = progression de la bulle de transcription le long de l’ADN

  2. Terminaison : séparation du complexe ternaire : proteine (ARNpol) / ADNds /ARNm


2 types de terminateurs :

  • Rho dépendante (90%)

Il a un site de reconnaissance au niveau de l’ARNm. Dépend d’une protéine rho sous forme d’hexamère.La vitesse de procession de rho est supérieure à celle de l’ARN pol. Donc si l’ARN pol fait une pause, il est rattrapé par rho qui va le décrocher en hydrolysant un ATP  dissociation du complexe ternaire.

Les terminateurs Rho dépendant représentent 5 à 10% des terminateurs chez les bactéries.

  • Rho indépendant (terminateur intrinsèque)

Il se suffit a lui-même pour terminer la transcription, il n’y a pas besoin de facteur protéique. Dès que l’ARN pol fait une pause, elle va se décrocher. Plus le terminateur sera fort (∆G*), plus l’énergie de formation de sa structure secondaire sera négatif. Lorsque cette séquence sera transcrite, il va y avoir formation d’une structure secondaire sur l’ARNm. Les boucles déstabilisent l’appariement ADN/ARN.

Le terminateur rho dépendant à une structure en « hair pine » ou épingle à cheveu :

Longueur tige

%GCélevé > augmentent la stabilité

Richesse en U à extrémité de l ARNm

l’ARN polymérase

Core polymérase : 2 α, 1β, 1β’


Pour l’élongation les 4 sous unités sont nécessaire et suffisantes mais pour l’initiation on a besoin d’un facteur d’initiation= facteur σ. Cela forme l’holoenzyme (α2ββ’)σ qui va permettre l’initiation.

Les ARN pol peuvent former des ARNm, ARNr, ARNt ou des petits ARN.

La reconnaissance de α2ββ’σ se fait sur la séquence promotrice. Le positionnement se fait grâce à σ qui se fixe au promoteur et permet la formation de l’holoenzyme.

Etapes :

  • Fixation sur ADN  du core polymérase au facteur σ  70 à 80bases protégées par le complexe (holoenzyme) et 20nt sont ouverts  ADN SS (facteur σ joue aussi un rôle : complexe ferméouvert + 1)

  • Initiation productive : 10 bases sont synthétisées puis il y a perte du facteur σ.

  • Complexe d’élongation formé : après synthèse de 15/20 bases d’ARN. Le facteur σ interagit avec le promoteur. Les différents domaines important pour l’interaction sont dans la partie Cterm de la protéine.

La séquence promotrice canonique :

  • -35 : TTGACA

  • -10 : TATAAT

L’ARNpol a un rôle au niveau des séquences promotrices (reconnaissance des séquences consensus).

Les séquences consensus


Les séquences canonique chez E. coli sont différentes pour les gènes de phases expo ou stationnaire ou latence.

Mutation de -35: modification de la reconnaissance

Mutation de -10 : modification de l’efficacité de la formation du complexe d’ouverture de l’ADN.

Chez E.Coli, les gènes de la phase expo sont différents des gènes de la phase stationnaire et des gènes de stress. Ils sont aussi différents que ceux de B.substilis ou de lactobacillus.

Dans la boîte -10 TATAAT les 3 premiers nucléotides (TAT) sont conservé mais il y a une variabilité autour. En générale il y a toujours une boîte -10 et les éléments en -35 diffèrent et il peu y avoir des éléments en plus.

Les sous unités α


Elles sont composées de 2 domaines globulaires avec un connecteur entre les 2 domaines. Elles peuvent jouer un rôle de stabilisateur, après l’interaction du facteur σ.

Méthode d’analyse des promoteurs


Il faut identifier le site d’initiation de la transcription. Avec la bioinfo on peut essayer de rechercher les séquences canoniques, on va peut etre trouver plusieurs candidats. Elle nous donnera juste L’ORF avec l’ATG et le codon STOP.

Extension d’amorces


On utilise un oligonucléotide antiparallèle et complémentaire, marqué radioactivement sur le phosphate γp 32 en 5’.

  1. Condition physiologique ou le gène est exprimé.

  2. Extraction ARN total : 90-95% ARNr + ARNt + 10-5% ARNm (pb: on ne peut pas se débarasser des ARNr car il n’y a pas de noyau) il faut donc mettre un inhibiteur de la RNase

  3. Hybridation de l’ARNm avec des amorces

  4. Ajout de reverse transcriptase

  5. Ajout de RNase

  6. On sait où est placé l’amorce donc on regarde la taille du fragment au nt près. Cela nous donne la distance le l’amorce au +1. On fait donc une Électrophorèse résolutif où on fait migrer sur Gel polyaccrilamide en condition dénaturante (comme gel de séquencage)

  7. Autoradiographie : l’échelle de PM est très fine, le séquençage d’ADN (Sanger) se fait a un 1nt de différence.

Nucléase S1


On fait migrer sur gel et on obtient la taille entre le +1 et le 3’.

identification des sites protégés par l’arn polymérase

retard sur gel


  1. Pruification des protéines de régulation

  2. ADNds marqué en 5’ chevauche la zone d’intérêt.

  3. Ajout de la protéine d’intérêt

  4. Essaie de liaison in vitro par électrophorèse

  5. Gel en condition non dénaturante.

empreinte à LA DNase




conclusion partie 1


L’architecture du promoteur détermine la force de transcription du gène

Promoteur sans séquence consensus  -

Promoteur avec TATAAT en -10  +

Promoteur avec base en -10 et -35  + + l’activation va dépendre de l’écart par rapport au promoteur type

Si trop proche  mauvais Si trop loin  mauvais.

la régulation transcriptionnelle chez les procaryotes




Elements Cis/Trans de régulation


Les éléments de l’ADN qui contrôlent l’expression d’un gène sont appelés éléments Cis de régulation.

Le promoteur de E.Coli en phase expo est -35 TTGAACA 16-18pb TATAAT.

La force intrinsèque d’un promoteur constitutif va être en fonction de 3 paramètres :

  • Présence des régions canoniques (ressemblance/abscence)

  • Distance entre les régions canonique

  • Promoteur d’un gène est régulé

régulation positive


Favorise l’attachement de l’ARN pol au promoteur. Souvent pour des promoteurs faibles, voir nuls.

Régulation négative


Blocage stérique de l’ARN pol. Souvent pour promoteur fort.
Le facteur de transcription Trans (protéique) agissent sue des éléments cis de régulation

exemple de l’opéron lactose


Quand les gènes sont très proches les uns des autres il n’y a pas besoin d’un site de fixation aux ribosomes à chaque fois. Ici chaque gène a son propre RBS.

induction par le lactose

3 sites opérateurs 


O1 (main opérateur) et O2, O3 (pseudo opérateur)

L’efficacité de la liaison dépend de la séquence cible.

Promoteur assez fort car un mismatch à -35 et 2 à -10 : promoteur quasi-canonique.

Régulation négative. En présence d’une molécule inductrice : levée de la répression du gène (ce n’est pas vraiment une activation).

Inducteurs 


Lactose ou analogues structuraux : allolactose, IPTG

Il y a fixation de l’inducteur au répresseur LacI,il va y avoir modification de la conformation et le répresseur ne peut plus se fixer à l’opérateur.

reconnaissance


Lac I se lie à la séquence opératrice sous forme de tétramère (chaque monomère a un site de fixation pour l’inducteur). Il se lie sur l’ADN sur les séquences cis palyndromique (séquence inversé répété imparfaite).

répression catabolique par le glucose


Glucose

lactose

effets

+

-

Fixation de lacI

Pas de complexes AMPc-CAP

0 transcription

+

+

Pas de fixation de Lac I

Pas de complexes AMPc-CAP

Lac I bloque transcription

-

-

Fixation de lacI

Formation de complexes AMPc-CAP

Initiation bloqué par Lac I

-

+

Pas de fixation de lacI

Formation de complexes AMPc-CAP

Transcription obtimale

Le glucose fait une répression catabolique chez les sucres et est utilisé comme sucre préférentiel. Les gènes de catabolisme du glucose sont constitutifs en phase expo. Donc si dans le milieu, il y a du glucose et du lactose, le glucose sera utilisé en premier puis le lactose  phénomène de Diauxie.c:\users\cris\desktop\sans titre.jpg

L’AMPc est une molécule signal de l’état physio de la cellule.

don

Donc quand [AMPc] est élevé :

  • Il y a signal de carence en source de carbone préférentiel. L’AMPc s’associe au niveau de la protéine CAP (carbolique activator protéine)

  • Pui activation de CAP qui va reconnaitre des séquences cis-régulatrice et va potentialisé l’initiation de la transcription.

protéine Cap


C’est un dimère de 22,5kDa mais une seule sous-unité peut suffire pour l’activation. Elle possède un motif de liaison à l’ADN et de fixation à l’AMPc.

CAP se fixe en -35 et interagit avec αCDT pour stabilisé l’ARN. La protéine CAP est un Co-activateur. La liaison de CAP induit une torsion de l’ADN qui stabilise l’ARN pol. La séquence de reconnaissance de CAP est de symétrie inversée.
Conclusion de la régulation de l’opéron lactose :

Quand le lactose et le glucose sont présents le niveau de transcription est bas. Et quand il y a du lactose mais pas de glucose le taux d’AMPc augmente ce qui permet une régulation positive par l’AMPc-CAP. Le lactose empêche la répression de LacI sur les opérateurs, le niveau de transcription est donc élevé.

Le répresseur se lie sous forme de tetramère sur 2 séquence opératrices O1/O2 ou O1/O3


L’affinité de LacI : O1>O3>O2

Il existe une séquence consensus pour la liaison au site opérateur. Plus l’affinité diminue moins le site ressemble à une séquence consensus. Quand [LacI] augmente on a une autorégulation sur le gène Lac I. O2 bloque la transcription

La courbure de l’ADN par CAP multiplie par 100 l’initiation de la transcription.


La régulation de la transcription : le modèle procaryote


On a vu que les séquences cis régulatrices sont souvent de type symétrique inversé, qu’une même séquence de régulation peut être présente sur différents gènes mais à des positions variable, que les régulateurs fonctionnent souvent sous forme de dimère et qu’un même gène peut être régulé par plusieurs protéines de régulation.
Mais on peut aussi regarder la stabilité de l’ARNm (endonucléase, Rnase) et la traduction (initiation opéron Trp) pour la régulation post transcriptionnelle.

On peut regarder si le tps de ½ vie et ses modification allostérique
Sites CAP : La position du promoteur est variable, l’orientation des 5pb aussi : dans l’opéron lac cap est en -61 et dans l’opéron GAL l’organisation est différente, CAP chevauche le promoteur (-50 à -23) il y a qu’une fixation de la protéine CAP.

régulation positive/négative

Régulation négative  represseur





Par induction : Pour l’opéron lactose, lacI va inhiber O1. Le répresseur est actif constitutivement. L’inducteur (IPTG) se lie au répresseur et il y a changement de conformation et levé de répression.

Par répression : Le répresseur n’est pas actif seul il a besoin d’un corépresseur.

Régulation positive  activateur





Par induction

L’inducteur va se lier à l’activateur et il va ya voir activation de la transcription.

Par répression

Le corépresseur se lie à l’activateur et il y va y avoir levé de l’activation activateur actif constitutivement



La liaison des activateurs à la région promotrice stabilise l’ARN polymérase et/ou modifie la conformation de l’ADN

Dérive par rapport au modèle : l’opéron Arabinose


Il n’y a pas de contact direct c’est plus les motifs topologiques de l’ADN impliqué par les protéines CAPs.

Plus CAP est proche du promoteur, plus l’activation est forte. Il n’y a plus l’activation de la transcription par CAP dans l’opéron LacZ et Gal.the image “file:///c:/documents%20and%20settings/benjamin/desktop/course%20material/biol%203451/from%20publisher/chapter_16/present/figures/16_15b.jpg” cannot be displayed, because it contains errors.

Cas n°1


L’arabinose reconnait ARA I et OP2 (séquence préférentielle)

Il y a liaison du monomère sur 2 opérateurs formation d’un dimère. Il va y avoir courbure de l’ADN et blocage des sites promoteur.

Promoteur C fait une autorégulation sur sa propre expression.

Cas n°2 (presence d’arabinose)


AraC est activateur. Elle se lie au niveau de AraI en dimère et ne se lie plus a O2.  il y a activation de l’opéron BAD.

Quand AraC devient trop important, elle s’accroche à O1 et masque le gène codant pour Arac = rétrocontrôle

Quand AraC est activateur, la liaison AraI > liaison O1
AraC est sur 2 conformations différentes en fonction de la présence ou non d’arabinose.

Les grandes familles de régulateurs

1 protéine capte un signal et régule la transcription.


La séquence primaire hélice-tour-hélice = domaine de liaison à l’ADN pour toutes les protéines régulatrices. Donc la régulation de se facteurs se fait en fonction de :

  • La séquence primaire du régulateur.

  • Le mode d’action : activateur, répresseur ou les 2

  • La localisation du domaine de liaison.

Il existe donc différentes familles.

Système de régulateurs à 2 composantes.


Régulation par les stress environnementaux ressentis par la bactérie

2 composantes =Une protéine membranaire qui joue le rôle de senseur du signal et une protéine effectrice, régulatrice qui est soluble dans le cytoplasme. Quand le signal est perçu, le senseur s’autophosphoryle sur HIS puis transfert d’un Phosphate à la protéine effecteur : on peut ensuite imaginer les 4 type de régulation vu précédemment.

La régulation post transcriptionnelle chez les b procaryote




Anti-terminaison et transcription

L’atténuation : modèle de l’opéron tryptophane

Régulation négative


Répresseur= TRPR corépresseur = Trp

Si [Trp] intracellulaire augmente  pas d’expression de l’opéron Trp EDCBA.

Si [Trp] intracellulaire faible  expression de l’opéron Trp EDCBA.

Atténuation de la transcription: présence d’une séquence transcrite leader codant un peptide de tête


Il y a un arrêt dans une séquence d’atténuation  transcription seulement de la séquence leader. Dans la région d’atténuation on a un terminateur intrinsèque de type Rho indépendant lorsqu’il y a du Trp dans le milieu.
En fonction de la présence ou non de Trp, la vitesse du ribosome est différente pour traduire la séquence leader car la séquence leader code pour Z TRPs.

En fonction du temps de traduction la structure secondaire de l’ARNm est différente.

En présence de Trp  la terminaison est rho indépendante et 3et 4 s’associent pour former la structure de terminaison. C’est une traduction rapide.

En absence de Trp  pas de terminaison intrinsèque alors la transcription est continue  et 2 et 3 s’associent entre eux. C’est une traduction rapide.

Donc quand [Trp] est élevé il y a liaison ARNt-Trp et le ribosome présent sur l’ARNm va modifier la structure et former une terminaison rho indépendante ; il y a un arrêt de la transcription.

Quand [Trp] est faible, l’ARNt n’est pas chargé par Trp donc le ribosome est lent et n’est pas au même endroit de l’ARNm, il y a transcription (pas d’arrêt de la traduction sur le peptide leader).

Au niveau embryonnaire


Quand Trp présent, on transcrit et traduit seulement un ARNm de 14codons et seulement 10% de TRP formé.

Si on delete la séquence d’atténuation on a 10 x plus de EDCBA transcrit. Si TRPr (régulateur répresseur) absent, on a une levé de répression X70.

bilan


La régulation (terminaison/antiterminaison) de la transcription. Cela dépend de la transcription du transcrit du gène de tête (en amont des gènes EDBCA).

L’antiterminaison est contrôlée par une protéine qui lie l’ARNm : modèle de l’opéron bgl



En présence de β-glucoside


Le BGLF membranaire va déphosphorylé BGLG, il va donc avoir formation de dimères de BglG qui vont interagir avec un ribosome et modifier la structure secondaire de l’ARNm. Il n’y a pas de terminaison au niveau des attenuateurs.

En absence de B-glucoside


Il y a phosphorylation de BglG par BglF donc pas d’interaction de BglG avec le ribosome donc formation de terminaison eu niveau des séquences atténuatrices.

Contrôle de l’initiation de la transcription

Régulation de la synthèse des porines par l’ARN antisens micF

Structure secondaire



Le ribosome ne peut pas se fixer sur le RBS. Il y a donc une régulation par déstabilisation de la structure via le ribonucléase (RNase). Le site de coupure est en amont ou dans la boucle. Après déstabilisation de la structure secondaire, le RNS est accessible et la traduction peut commencer.

Arn antisens


L’ARN antisens masque le RBS avec un anti-transcrit (au – de la zone RBS)

Chez E.coli (Gram-) il y a 2 types de porines OmpF et OmpC dont le ratio se fait en fonction de l’environnement (osmolarité). Quand le taux de Nacl augmente le ratio change.

C’est un système à 2 composants : envz (prot senseur mbr)et OmpR (facteur transcription)

Stimulation de la transcription des 2 gènes :

  • OmpC  augmentation d’OmpC dans la mb

  • micF  ARN anti-sens de OmpF  down régulation de OmpF

Au niveau de la séquence RBS d’OmpF on a une hybridation de l’ARNm avec micF. La liaison de l’ARNm micF à l’ARNm OmpF le déstabilise et favorise sa dégradation. De nombreux autres petit ARN sont impliqué s dans la régulation de la synthèse des protéines de l’enveloppe externe bactérienne.

Autorégulation : synthèse des protéines r ribosomiales


Les gènes dans les protéines ribosomales dees facteur de synthèse protéiques et des sous unités de l’ARNpol sont entremêlés en un petit nombre d’opérons qui sont régulés de façon autonome. Lorsque l’ARNr est dispo, les protéines s’associent avec lui. Il n’y pas de protéines r libre et la traduction des ARNm des protéines r continue. Lorsqu’aucun ARNr n’est dispo les protéines r s’accumulent. L’une des protéines r se fixe à l’ARNm et empêche sa traduction.

Régulation globale


Il y a 7 régulateurs principaux pour régulée 5000gènes.

Régulons : L’ensemble des gènes sous le même régulateur.

Stimulons : Ensemble des gènes qui répondent à un même stimulus (contrôle environnementale)

Il y a des régulateurs assez peu spécifique de leur cible, selon la structure secondaire de l’ARN et du degré de compaction de l’ADN. 50% des gènes bactériens sont exprimés en fonction du degré de compaction de l’ADN.

Le degré de compaction régulé par les histones libres. Le facteur σ est un régulateur lobale sui initie la transcription en fonction des conditions environnementales  différents promoteurs.

Les protéines histones libres :

  • IHF : intégration de différents facteurs  type histones libre. Les facteurs biologiques favorisent les C.O. et modifie la courbure de l’ADN

  • Xis : exisase (facteur phagique) agit sur le site attR et attL. C’est une protéine d’origine bactérienne. (FIS : coupure d’ADN)

  • Hu et Hus : potentialise les réactions.

  • Facteur σ :

  • σ e : permet de positionner l’ARNpol en -10 et -35 (phase expo)

  • σ phase expo : σ70 codé par rpoD

  • rpoN sollicité quand il y a carence en source de N

  • rpott et rpoE qd stress de T°

  • phase stationnaire : promoteur différents reconnaissance par σs différentes

1er moyen de contrôle  facteur σ car permet de contrôler un grand nombre de gènes.

méthodes d’études de la régulation des gènes procaryotes

gène rapporteur

Fusion transcriptionnelle 



Comment le gène est-il transcrit dans différentes conditions ? Comme des gènes de virulences des bactéries pathogènes (phagolysosome)  on regarde in situ ou in vitro en culture pure. Il n’a pas de promoteur propre mais possède un site de fixation aux ribosomes RBS
Exemple de gènes :

  • lac Z : galactosidase, fusion transcriptionnelle (Gram -)

  • Gus : glucurosidase (Gram -)

  • CAT : chloramphenicol (Gram +)

  • marqueur fluorescents : GFP (green), RFP (red), YFP (yellow)


Les gènes rap transcriptionnel n’ont pas de promoteur donc on étudie le promoteur WT mais ils ont un site de fixation RBS. L’insertion des gènes rap se fait entre le +1 et le terminateur. Chez les gènes polysistroniques, l’insertion se fait plutôt en tête. On insert les plasmides dans des bactéries d’études pour une transformation. Le plasmide possèdent une origine de réplication et un gène de résistance a un antibiotique qui sert a forcer le maintient du plasmide.
Avantage : clonage, transformation

Inconvénient : nombre de copies différent (1 copie du gène pour le sauvage mais ca dépend du nombre de copies du plasmide), variations de la stabilité…

Donc si le plasmide à un haut nombre de copies (50/cellules), il faut que les protéines régulatrices puissent fonctionner pour tous les plasmides.
Pour avoir des recombinaisons homologues : construction sur un plasmide navette (E.coli) qui peut se répliquer et la bactérie d’étude qui ne se réplique pas.

Après la transformation, on peut choisir de sélectionner grâce à l’antibiotique 1 ou grâce aux deux antiobio. En présence d’antibio on va forcer la recombinaison.

Il va y avoir expression du gène dans un contexte WT.

Si on étudie l’expression d’un gène par un régulateur, les promoteurs sont souvent régulés par leur produit de synthèse. Si c’est le cas, dans le contexte WT, il y aura une influence sur l’expression.

On peut avoir 1 C-O (en amont ou en aval) ou 2 C-O

Fusion traductionnelle


Il n’y a pas de promoteur propre, pas de site de fixation aux ribosomes RBS, le cadre ouvert de lecture a le gène rapporteur et l’insertion de la cassette se fait en phase avec le gène d’étude.

Cela va nous renseigner sur la transcription, la traduction/stabilité des protéines et la localisation de la protéine.

RT Q PCR


Si non quantitative, il suffit de peu de cycle.

Si quantitative, cela se fait en temps réel.

Avantage : on a le phénotype WT, on a un nombre de copies par gène et c’est plus rapide.

Désavantage : plus cher !

Microarray


Version globale de l’expression de tous les gènes.

RG : régulation chez les procaryotes (Dupont 2010-2011) Page


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