Chapitre 2 : Les Méthodes d’analyse de la Cellule – Bernard Rousset








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Chapitre 2 : Les Méthodes d’analyse de la Cellule – Bernard Rousset

Sommaire
PARTIE 1 : Approches et Moyens d’études de la Cellule – Page 1
PARTIE 2 : Méthodes d’analyse de la forme et de la structure des cellules et des organites – Page 10
PARTIE 3 : Méthodes d’études des constituants moléculaires de la cellule - Page 18
PARTIE 4 : Quelques méthodes d’études du fonctionnement cellulaire – Page 21


PARTIE 1 : Approches et Moyens d’études de la Cellule
I – Source de matériel biologique et utilisations principales.
A) Organes-Fragments d’organe (Tissus)

Source

Animaux d’abattoirs

Animaux de laboratoire

Homme

Législation

Aucune

- Loi d’agrément des locaux.
- Personnel formé.

- Loi Hurriet
- Comité d’éthique
- CPP

Accessibilité

Facile

- Selon disponibilité

- Travail de Diagnostic
- Opération pour tissus anormaux.

Temps de Recueil

Court

Court

Long


B) Lignée Cellulaire
- Lorsque l’on veut travailler sur des lignées cellulaires, on utilise des cellules immortalisées càd des cellules capables de se multiplier de manière infinie.
1 - D’où proviennent ces cellules ?
- Elles sont soit issues de Tumeurs soit elles résultent de modifications génétiques expérimentales.
Fascicule.

2 – Conservation de ces lignées
- La conservation par congélation est la technique la plus répandue. Cependant, il existe différentes conditions de conservation qui ne dépendent que des buts poursuivis (ce que l’on veut faire de ce matériel biologique) qui peuvent être la viabilité, le maintien de la structure ou le stockage simple du matériel biologique.

II – Modalités de Conservation du matériel biologique
- La technique de préservation des structures et des constituants cellulaires est la Congélation. Cependant, selon l’usage que l’on veut faire a posteriori de ces échantillons, ces derniers ne doivent pas être conservés dans les mêmes conditions. Il existe donc plusieurs techniques de congélation :


Conditions Standards

A très basse température

Congélation par Cryoprotection

- 20 à – 80°C



-100°C

- Technique avec ajout de Glycérol et DMSO
- Diminution progressive de la température.
- Stockage entre -80°C / -196°C
- L’eau passe de l’état liquide à l’état vitreux.

Lyse cellulaire (= Destruction des structures cellulaire mais conservation du contenu.)



Mort Cellulaire (=Conservation des Structures.)

Survie de la Cellule


III – Modalités de Fixation des cellules et tissues pour examen morphologique
- La Fixation, c’est le traitement qui sert à établir des ponts chimiques entre certaines macromolécules afin de figer des structures cellulaires dans un certain état.
A) Composés utilisés
- Aldhéyde : C’est une fonction chimique qui correspond à l’oxydation d’un alcool primaire.
Pour fixer des tissus animaux, on utilise du Formaldéhyde ou du Glutaraldéhyde.

B) Réactions
- Les réactions qui s’enchainent se font avec les fonctions amines primaires.
Fascicule.

IV – Utilisation principales du matériel biologique
Lorsque l’on veut travailler sur un échantillon viable, il faut :
- Connaitre Le nombre de cellule viables dans l’échantillon (Test du Bleu de Tryptophane)
- Séparer et trier les différentes cellules en présence pour se concentrer sur un seul type de cellules.

A) Numération par comptage cellulaire
- Lames de Verre qui présentent des rayures sur sa partie centrale permettant d’obtenir des volumes définies. (Lame Thomas ou Malasse )
- On dispose dans ces rayures un goutte cellulaire (fraction aliquote : 20µl sur 5ml)
- On place au-dessus de la lame, une lamelle qui piège une certaine hauteur de liquide fixe que l’on connait.
- On peut compter le nombre de cellules présentes dans un champs microscopique (=Volume) connu.

B) Numération par quantification d’ADN
- On va compter les cellules en faisant une mesure de l’ADN. En effet, au sein d’un organisme connu, toutes les cellules on la même quantité d’ADN par noyau.
Chez l’Homme, un noyau contient 8 pg d’ADN
- Dans une fraction aliquote, on connait la quantité d’ADN et donc la quantité cellulaire présente.

V – La culture des cellules : Primaire & Secondaire
- Culture primaire : Culture de cellules fraichement isolées.
- On fait de manière fréquente des cultures de cellules adhérentes au support.

A) Conditions d’ensemencement
1 – Dans les flacons traités pour la culture cellulaire
- Boite de Pétri : 3 à 30 cm de Diamètre
- Flacon : 25 à 500 ml
- Plaques multi-puits : < 30 ml ; Culture d’une seule cellule par puit.

2 – Dans un milieu complexe
- Il existe de nombreuses sortes de milieux complexes différentes les uns des autres. Cependant, tous contiennent :
- des éléments essentiels à la synthèse des constituants et au métabolisme (ions glucose, acides-aminés, vitamines...) Il s’agit de tout ce que n’apporte plus la cellule.
- Sérum : Sérum de Veau Fœtal en Général (= SVF) dont le pourcentage, par rapport au milieu est de 0,5 à 10 %. Le SVF est un Facteur :
- D’adhésion
- De croissance
- D’Hétérogénéité.
- D’antibiotiques : nécessaires pour la culture de cellules eucaryotes pour empêcher la prolifération de cellules procaryotes (=Bactéries.)

3 – Densité d’ensemencement
La densité d’ensemencement est variable suivant les buts suivis de la création d’une lignée cellulaire. Cette densité d’ensemencement varie entre 104 et 106.

4 – Volume d’ensemencement
- Le Volume d’ensemencement est également variable. On essaye toutefois de laisser un mince film de 2 à 3 mm pour favoriser les échanges gazeux. En effet, les cellules présentent des besoins en apport d’Oxygène et de rejet de CO2..

B) Conditions de culture
- La culture cellulaire est maintenue dans un incubateur. Il s’agit d’un flacon jamais fermé présentant, pour la survie de la lignée, les caractéristiques suivantes :
- L’atmosphère est constituée d’un mélange de 95% d’air et de 5% de CO2. Celui-ci contrôle le pH. En effet, il est nécessaire pour cultiver des cellules que l’on travaille dans un milieu tamponné (milieu où le pH est contrôlé par un système tampon.)
- La température est réglée à 37°C (Température physiologique de l’organisme humain.)
- Le milieu dans lequel on travaille, est un milieu stérile afin d protéger non seulement le milieu, mais également l’expérimentateur.
C) Devenir des cellules
1 – Adhérence au support
- Dure de quelques heures à 24H.
- L’adhérence est la capacité d’une cellule à se fixer au support, càd de s’adapter au milieu dans lequel elle va effectuer sa culture.
2 – Evolution des cellules dans les boites de culture.
2.1 – Les cellules ne se multiplient pas
- Si l’ensemencement est à forte densité, on doit obtenir une couche cellulaire continue.
- Si l’ensemencement est à faible densité, on doit obtenir des îlots de cellules (cellules isolées ou en petits groupes.)
2.2 – Les cellules se multiplient
- Si on a un ensemencement à faible densité et que les cellules se multiplient, on observe une division cellulaire. Celle-ci s’achève quand il n’y a plus de possibilités de se multiplier (milieu trop étroit.) A ce moment précis, on dit que les cellules sont arrivées à confluence.
- Suite à ce moment de confluence, on traite légèrement les cellules avec un enzyme protéolytique (= capable de scinder une protéine – La Trypsine par exemple.)
- Nous avons donc créer une culture secondaire.

D) Devenir des cellules en culture
- La vitesse de multiplication d’une lignée cellulaire est caractérisée par son Temps de Doublement de Population (TDP)

E) Expression de la différenciation
- Chaque cellule est spécifique est cette spécificité se manifeste lors de la création de lignée cellulaire, par l’apparition de caractéristiques fonctionnelles conservées par les cellules. Il s’agit de la réacquisition (= les cellules retrouvent les caractéristiques morphologiques et les propriétés fonctionnelles qui les caractérisent.)
Exemple de spécificités réacquises :
- Neurones = Formation d’extensions
- Cellules cardiaques = Fréquences de Battements.
- Cellules épithéliales = Réorganisation Tridimensionnelle.

VI – Etablissement de lignées cellulaire : Le Clonage et la Fusion Cellulaire.
Le Clonage : qu’est-ce que c’est 
C’est l’obtention d’une population à partir de la multiplication d’une seule cellule.

Comment l’obtient-on ?
On prend une culture de cellule en suspension que l’on dilue pour avoir une cellule par puit de culture.
On cultive cette cellule jusqu’à obtenir un clone puis une lignée cellulaire clonales. On peut par la suite faire un stockage de cette lignée clonée par congélation.

A) Etablissement de lignées cellulaires
- Deux possibilités
1 – A partir de cellules normales
- Les cellules dites « normales » sont des cellules incapables de se multiplier spontanément. Il leur faudra donc acquérir cette caractéristique de multiplication infinie que l’on nomme ’immortalisation des cellules.
- On donne cette capacité aux cellules (l’immortalisation) en introduisant dans ces cellules, un ou plusieurs gènes exogènes qui transforment ces cellules. Celles-ci vont donc pouvoir se multiplier de manière infinie.
- On introduit ce gène dans une cellule hôte à l’aide d’un vecteur plasmidique (issu de bactérie) ou vecteur viral (issu d’un virus.)

Attention vocabulaire ! On transfecte un gène vers une cellule eucaryote mais on transforme un gène vers une cellule procaryote.

Lorsque le gène s’exprime au sein d’une cellule, on obtient des plages de cellules qui se multiplient. Cependant, l’affectation d’un gène dans le caryotype d’une cellule peut présenter des inconvénients. En effet, on ne sait jamais si ce gène va être intégrer ou non par la cellule. C’est pourquoi on transfecte certains gènes uniquement dans des lignées dont on connait les diverse caractéristiques.

2 – A partir de cellules tumorales (animales ou humaines)
- Pour créer une lignée cellulaire clonale à partir de cellules tumorales, il suffit de mettre directement ces cellules en culture et on obtiendra des plages où ces cellules se multiplient.
- On constate ici que la caractéristique de multiplication infinie est définie initialement dans les cellules tumorales.

B) Culture des lignées cellulaires
- La culture de lignée cellulaire présente les mêmes caractéristiques que la culture de lignées cellulaire clonales.
- On essaye d’identifier la subculture d’un lignée cellulaire (=le nombre de passages subis par les cellules depuis la création de la lignée en question, que ce soit des cultures primaires ou secondaire.)
- Même si des conditions générales existent pour la création de lignées cellulaires, chaque type de lignée cellulaire peut nécessiter des requis particuliers (proportion de Sérum…)
- Une culture effectuée dans un milieu chimiquement défini ne requiert pas de Sérum !

C) Autre modalités de culture (pour que les cellules puissent adhérer.)
1 - Culture de cellules sur plastique traité
2 – Culture de cellules sur Matrice extracellulaire
L’environnement péri-cellulaire est constitué de Collagène et d’autre protéines.
3 – Culture de cellules sur Micro-Porteur
Ce procédé est utilisé si on requiert une grande quantité de cellules.
4 – Culture de cellule en suspension



D) Fusion cellulaire : Génération de cellules hybrides
Etapes dans le Fascicule.
Résumé des quatres étapes :
- Addition d’un agent de Fusion (Polyéthylène Glycol)
- Culture dans un milieu complexe
- Evolution des structures cellulaires dans un milieu sélectif
- Clonage des cellules hybrides formées à partir des Hétérocaryons (=fusion des noyaux des deux cellules mises en suspension initialement.)

VII – Séparation et Tri cellulaire
A) La centrifugation
- La centrifugation est un moyen de séparation utilisant la force centrifuge.
- Cette force varie en fonction de la vitesse de rotation v et de la distance d séparant l’élèment à séparer et le centre de la rotation. D’où : F = f(v,d)
Exemple d’utilisation :
- Séparation des cellules sanguines en Plaquettes, GR, GB et PMN.
- Il existe deux types de centrifugation : Différentielle & Isopcynique.
1 – Centrifugation différentielle
- Elle sépare les éléments selon leur taille.
- Les éléments les plus gros se retrouvent au fond du culot et les plus léger dans le surnageant.
2 – Centrifugation isopycnique
- Elle sépare les éléments selon leur densité
- On définit au préalable un gradient de densité où les éléments vont tendre vers leur propre densité.

La centrifugation est une méthode de choix pour séparer non seulement des cellules, mais aussi des particules.

B) Tri cellulaire par adsorption
- Si on met un mélange, constitué de 2 types de cellules A et B, dans un milieu contenant des Ac fixés au support et reconnaissant les cellules A, les cellules A vont se fixer au support. Par lavage, on peut éliminer les cellules B et ne conserver ainsi que les cellules qui nous intéressent.
- Par la suite, il faut enlever les liaisons entre les cellules A et les anticorps pour pouvoir garder que les cellules A. On appelle ce procédé la Désorption.

C) Analyse des cellules par Cytométrie en flux
1 – Présentation
- La Cytométrie en flux est une méthode de tri des cellules par action d’un faisceau lumineux.
2- Fonctionnement
- Les cellules sont conservées en suspension (vibration de l’appareil) et sont analysées et triées une à une par un analyseur qui varie en fonction de la taille, du nombre de cellules et de l’intensité de fluorescence.
- On dispose d’un réactif qui reconnaît telle ou telle substance à la surface des cellules de la lignée désirée.
- Un dispositif donne une charge + ou – aux gouttes contenant les cellules. Cette charge varie selon la cellule qui vient d’être analysée.
- les gouttes chargées passent dans un champ électrique très puissant pendant un très court instant au cours duquel on observe un déviation des gouttes. Il y a, ce moment-là, un tri des gouttes en fonction des cellules qu’elles contiennent.
- Les cellules non triées sont regroupées dans un flacon à part.
Cette opération dure quelques millisecondes pour une cellule donnée, ce qui permet un très grand rendement.

VIII – Lyse cellulaire et isolement d’organite de compartiments cellulaires.
A) Préparation d’extrait tissulaire et lyse des cellules
Fasicule
B) Homogénéisation des tissus et lyse des cellules
Fasicule
- Cette homogénéisation s’effectue dans un milieu isotonique, à un pH de 7-2 à 7-4 et à une température de 0 à 4°C.
- Il existe 5 techniques d’homogénéisation :
- Par pression : Broyage des cellules
- Par pression dans un Tamis : Passage d’élément plus petits que la cellule.
- Par Ultrasons : Utilisation des hautes fréquences.
- Par utilisation d’un détergent doux : On fait des trous.
- Par Congélation.
Développement de la technique de Broyage des cellules par pression.
- On effectue une rupture et une destruction des parois cellulaires par exercice de forces de pression et de cisaillement entre le Piston et les parois de l’Homogénéiseur.
- Le moteur effectue une rotation de 500 à 3000 tours/minute (Appareil de Potter ou Dounce.)
- Il faut trouver un compromis entre proportion de cellules lysées et la proportion d’organites intacts.
- Objectifs de cette destruction cellulaire :
- Analyse du contenu cellulaire
- Mise en place de systèmes expérimentaux simplifiés afin d’étudier un processus biologique (sans trop de réactions parasites)
- Reconstitution des ensembles fonctionnels à partir de sous-fractions. Autrement-dit, on identifie les acteurs d’un processus biologique en reconstruisant le processus à partir des organites séparés. On fait alors ce qu’on appelle
une étude dans un système acellulaire.

C) Sous fractionnement cellulaire
1 – Présentation
- Comment séparer les différentes composantes d’une cellule ? Par sédimentation selon la taille et/ou la densité.

- Il existe deux types de centrifugeurs :
- Le centrifugeur classique : 20 000 tours/minute (200g) ; Réfrigération
- L’ultracentrifugueur : 80 000 tours/minute (800g) ; Réfrigération sous-vide.

- La Force de centrifugation : L’unité de la force exercée dans le centrifugueur est la force gravitationnelle notée « g »

2 – Méthode différentielle
- A partir d’un homogénat cellulaire de base, on utilise la centrifugation pour séparer les organites. Cette séparation se fait de manière ordonnée (selon la taille.)


Force exercée (en g)

Temps (en minutes)

Organites obtenus

600

10

Noyau

15 000

10

Mitochondrie
Lysosome
Peroxysome

100 000

60

Mb Plasmique
Microsome (RE)

300 000

120

Edifice moléculaire (ribosomes)


3 – Méthode Isopycnique
- Il faut contrôler et analyser la pureté des fractions obtenues. Pour ce faire, on effectue une mesure de contenu à l’aide de marqueurs spécifiques aux fractions.
- Ces marqueurs sont principalement des enzymes.


Marqueurs

Organites reconnu par le marqueur

Cytochrome Oxydase

Mitochondrie

Phosphatase acide

Lysosome

Catalase

Peroxydase



D) Analyse post-isolation
1 – Détermination de l’enrichissement en organite
Mesure de : - Activité spécifique =

- Facteur de Purification =

- Rendement de la purification =
2 – Détermination du degré de pureté.
- Il s’agit de quantifier la déplétion en marqueurs n’appartenant pas à la fraction (caractéristique d’une sous fraction potentiellement contaminante.)
Mesure de : - Facteur d’appauvrissement =

- Rendement de la déplétion =
Exemple :




Homogénat initial

Fraction purifiée

Activité

6 000 U

2 400 U

Protéines

1 000 mg

20 mg

Activité spécifique du marqueur.

6U/mg

120 U/mg


AS (HI) = 6 000 / 1 000
= 6
AS (FP) = 2 400 / 20 =
120
FP = 120 / 6 =
20
RP = 2 400 / 6 000 =
0,4
FA = 6 / 120 =
0,05


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