Introduction aux protéines

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1.1.2 EXEMPLE DE L'ADAPTATION A L'UTILISATION DU LACTOSE
Plusieurs types de mutation peuvent interférer avec l'utilisation du lactose.

Des mutations dans le gène Z empêchent le catabolisme du lactose par absence de b-galactosidase, des mutations dans le gène Y empêchent la pénétration active du lactose à l'intérieur de la cellule. Dans ces deux cas le phénotype, symbolisé par lac^-, c'est à dire impossibilité d'utiliser le lactose, résulte d'un défaut enzymatique.
D'autres mutations perturbent d'une façon tout à fait différente l'utilisation du lactose : elles affectent la production de trois enzymes en même temps (b-galactosidase, perméase et transacétylase). Plusieurs de ces mutations entraînent un phénotype constitutif c'est à dire production d'enzymes en absence d'inducteur.

Etant donné que les trois gènes cartographient côte à côte sur le chromosome, on peut supposer que leur expression est régulée par un même système et que les mutations constitutives affectent non pas une production d'enzyme mais un élément de contrôle. Cet ensemble forme ce que l'on appelle un opéron bactérien.
Les premières mutations constitutives étudiées ont été appelées I^-et sont localisées près du gène Z, par la suite on a caractérisé des mutants constitutifs O^c, ces mutations sont situées encore plus près de Z.
L'analyse de ces mutants par des expériences très élégantes faisant appel à des diploïdes partiels a permis au groupe de Monod et Jacob d'élaborer le célèbre modèle de régulation de l'opéron lactose par répression de la transcription.
Le tableau ci-dessous rappelle les caractéristiques phénotypiques des mutants utilisés.

GENOTYPE	PHENOTYPE
I⁺ O⁺ Z⁺ Y⁺	sauvage (inductible)
I⁺ O⁺ Z^- Y⁺ I⁺ O⁺ Z⁺ Y^-	Lac^- (non inductible)
I^- O⁺ Z⁺ Y⁺ I⁺ O^c Z⁺ Y⁺	constitutif

Pour la conjugaison, des souches Hfr (F⁺), sensibles à la streptomycine (Sm^s) sont utilisées comme cellules donneuses, les souches receveuses sont résistantes à la streptomycine (Sm^r). Après contact, les cellules sont étalées sur un milieu contenant de la streptomycine et contenant ou non un inducteur (ici de l'IPTG). Le tableau suivant résume les principaux "croisements" réalisés et indique la production de b-galactosidase en présence ou en absence d'inducteur (+ indique une production, - son absence).

	sans inducteur	IPTG
F⁺Sm^sI⁺O⁺Z⁺ / Sm^rI⁺O⁺Z^-	^-	+
F⁺Sm^sI⁺O⁺Z⁺ / Sm^rI^-O⁺Z⁺	^-	+
F⁺Sm^sI⁺O⁺Z⁺ / Sm^rI⁺O^cZ⁺	+	+

*Remarque : Ce tableau est à analyser avec beaucoup d'attention, l'interprétation de tels résultats a valu le prix Nobel à F. Jacob, J. Monod et A. Lwoff.

1.1.3. MODELE DE REGULATION PAR REPRESSION DE LA TRANSCRIPTION
La présence de b-galactosidase chez un diploïde partiel Z^-/Z⁺ indique qu'une complémentation est possible, l'allèle Z⁺ de la cellule donneuse est exprimé dans le cytoplasme de la cellule receveuse (on peut dire que l'allèle Z⁺, sauvage, est dominant par rapport à Z^-, muté).
De même, la présence de l'allèle I+ rétablit le contrôle normal (inductible) de l'expression du gène Z. On peut en conclure que ce gène est exprimé en une protéine capable d'agir sur la transcription de l'opéron. Monod et Jacob proposent que cette protéine (produit du gène I) soit un répresseur de la transcription lorsque l'inducteur est absent (l'induction serait en fait une levée de la répression).
Les résultats obtenus avec les diploïdes partiels O⁺/O^c sont très différents, il n'y a pas complémentation, l'allèle muté semble dominant par rapport au sauvage. Ceci ne peut s'expliquer que si le locus O n'est pas un gène exprimé mais une séquence particulière d'ADN que l'on appellera le site opérateur. Le schéma de fonctionnement de l'opéron serait alors le suivant : en absence d'inducteur, le répresseur produit par le gène reconnaît spécifiquement le site O et s'y fixe. L

'encombrement de ce complexe (on découvrira plus tard que c'est en fait un tétramère qui se fixe) est tel que l'ARN polymérase est incapable de se fixer au site promoteur. Le promoteur étant unique pour les trois unités de fonction Z, Y et A, on comprend que la répression bloque la transcription de l'ensemble.

Comment se fait l'induction ?
U

ne propriété très intéressante de certaines protéines est celle d'allostérie : la fixation d'une molécule particulière (ligand) peut provoquer une modification globale de la structure tridimensionnelle d'une protéine réceptrice. C'est ce qui ce produit ici, le lactose a une affinité pour la protéine répresseur et sa liaison provoque une transition allostérique de celui-ci. Si l'on tient compte du fait que l'interaction d'une protéine avec une séquence d'ADN nécessite l'établissement de liaisons hydrogène entre des atomes précis d'acides aminés précis et des atomes précis de bases, la déformation de la protéine ne permettra plus cette interaction et le complexe répresseur-inducteur sera incapable de se fixer à l'opérateur.

Le principe d'interaction protéine (en tant que séquence spécifique d'acides aminés conditionnant sa structure tridimensionnelle) et séquence d'ADN permet de comprendre l'effet des mutations I^- et O^c.
U

ne mutation dans le locus I conduit à une altération de la structure du répresseur voire à une absence de la protéine (allèle nul). Dans tous les cas, une liaison répresseur - opérateur ne peut s'établir et l'ARN polymérase peut s'installer à l'opérateur. Si le répresseur possède une structure correcte mais que la séquence opératrice est altérée par une mutation (Oc par exemple), le résultat est le même : aucune possibilité de former un complexe répresseur - opérateur ; la transcription de l'opéron est possible en permanence.

1.1.4 LE REPRESSEUR
Une confirmation d'un mode de régulation par répression a été apportée par des mutations I^s, s signifiant "super-réprimé". Ces mutants sont incapables d'utiliser le lactose car l'opéron est réprimé en permanence, le lactose ne peut induire la transcription. Les mutations affectent bien le gène I, mais dans une région importante pour la formation du complexe répresseur - inducteur. La région essentielle pour la liaison du répresseur à la séquence opératrice étant intacte, l'état réprimé est stable.
Ces observations permettent d'aborder un aspect plus général des protéines de régulation, celui de domaines fonctionnels spécialisés. L'analyse détaillée de la protéine après clonage du gène I dans un vecteur d'expression et surproduction par des clones bactériens transformés (voir le chapitre correspondant) confirmera ce concept. Les mutations I^-, I^s et d'autres ne sont pas disposées de façon aléatoire dans le gène mais leur cartographie reflète le fait qu'une partie de la protéine codée est essentielle dans la reconnaissance du site opérateur, une autre région est nécessaire pour la fixation de l'inducteur et la transition allostérique, une autre permet la formation d'un tétramère. Cette notion de protéines de régulation modulaires, séparables en domaines fonctionnels, se retrouvera chez les Eucaryotes.
1.1.5. OPERON INDUCTIBLE ET OPERON "REPRESSIBLE"
L'opéron lactose ne fonctionne que s'il est induit par une molécule effectrice capable de lever l'effet du répresseur, il est dit inductible. Dans d'autres cas c'est l'inverse, la molécule effectrice provoque la répression de la transcription, l'opéron est dit répressible.
Un exemple typique nous est fourni par un opéron intervenant dans la biosynthèse du tryptophane.
*Remarque : l'opéron lactose intervient dans le catabolisme, l'opéron tryptophane intervient dans l'anabolisme.

C

et opéron comporte cinq gènes codant pour des enzymes impliquées dans la synthèse du tryptophane (les cistrons trpE, D, C, Bet A) groupés, sous la dépendance d'un seul système promoteur - opérateur. Un gène, trp R, qui ne fait pas partie de l'opéron, code pour un répresseur spécifique de l'opéron tryptophane. Cette protéine est incapable de se lier au site opérateur, et par conséquent inactive, tant qu'elle n'est pas complexée avec une molécule effectrice : le tryptophane lui-même. Il agit donc comme un corépresseur dans ce mécanisme de régulation en retour par le produit final de la chaine métabolique de l'opéron.

1.1.6 CONTROLE NEGATIF ET CONTROLE POSITIF
Les gènes soumis à un contrôle négatif ne sont pas transcrits si un répresseur est lié à l'opérateur. C'est le cas des opérons lactose ou tryptophane.
Les gènes soumis à un contrôle positif ne sont transcrits efficacement que si une protéine régulatrice favorise l'initiation.
L'opéron lactose est également soumis à un contrôle positif. Il a été précisé au début de ce chapitre que la transcription est induite si l'on remplace le glucose par du lactose comme seule source de carbone dans le milieu minimal. En effet, si l'on ajoute du lactose, l'opéron n'est pas transcrit tant que le glucose n'est pas épuisé. Ce phénomène, qui concerne de nombreux opérons du catabolisme est appelé "effet glucose" ou encore "répression catabolique". Il repose, comme les autres modes de régulation sur une protéine à régulation allostérique et une molécule effectrice. Deux types de mutations abolissent l'effet glucose : le premier concerne les gènes impliqués dans la formation de l'adénosine monophosphate cyclique (AMPc,) notamment celui de l'adénylate cyclase, le second dans un gène codant pour une protéine appelée "CAP" comme protéine activatrice du catabolisme.
O

n a pu montrer que le glucose freine la production d'AMP cyclique à partir de l'ATP et maintient un très faible niveau d'AMPc. Lorsque le glucose diminue, la concentration en AMPc augmente, or cette molécule peut former un complexe spécifique avec la protéine CAP. Il en résulte une modification de la structure tridimensionnelle et le complexe est capable de se fixer sur l'ADN, au niveau d'une séquence particulière appelée site CAP, située un peu en amont du promoteur. La liaison entraîne une contrainte topologique de la double hélice d'ADN qui favorise l'initiation de la transcription.

1.2 CONCLUSION
Les quelques exemples qui ont été choisis (il existe d'autres mécanismes qui n'ont pas été décrits ici) montrent que quel que soit le mode de contrôle, positif ou négatif, quelles qu'en soient les modalités dans le détail, le schéma de base est le même.
Les gènes codant pour des enzymes (tels que LacZ, Y, TrpA ...) sont appelés des gènes de structure : leur produit participe directement à la structure de la cellule ou à son métabolisme (les enzymes, les protéines membranaires, les protéines des ribosomes etc sont codées par de tels gènes. A côté de celà, d'autres éléments informatifs interviennent dans le contrôle de l'expression des gènes de structure.

Au niveau transcriptionnel, on envisage des gènes de régulation codant pour des protéines sans fonction enzymatique, des protéines de régulation (le répresseur, la protéine CAP en sont des exemples) qui agissent en trans (sur un site pouvant être éloigné) en se fixant spécifiquement à une séquence précise d'ADN que l'on appellera site de régulation, ces sites assurent une cis-régulation sur l'efficacité du promoteur situé sur la molécule d'ADN. La relation avec l'environnement intra ou extra cellulaire est assurée par des molécules effectrices (le lactose, l'AMPc en sont des exemples). La souplesse de la régulation est liée aux propriétés de modifications allostériques des protéines de régulation, qui, selon leur conformation assurent ou n'assurent pas leur fonction.

Si la notion d'opéron est restreinte aux cellules Procaryotes (chaque cistron eucaryotique possède son propre promoteur), on verra que ce schéma de base est applicable au contrôle de l'expression des gènes des Eucaryotes.

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