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Animals and general procedures

Adult male Wistar rats (Charles River, L'Arbresle, France) of initial BW 230 - 240 g, were housed individually in metabolic cages with free access to tap water and powdered food (A03, Safe, Villemoisson/Orge, France) at all times before and during the experiments (except for one rat group in Experiment E, see further). They were accustomed to the cages for five days before the experiments. All experiments were carried out in conscious undisturbed rats and involved no prior water load, no instrumentation, and no pre-treatment. Each experiment included 24 to 36 rats studied in parallel on two successive days. On day 1 (basal), rats were injected at time 0 (around 10 a.m.) with the vehicle(s) only, and on day 2 (experimental), with AVP and/or various drugs (see details below). Urine was collected for 6 h starting just after the injection(s). Urine volume was determined gravimetrically, assuming the density of urine was equal to unity. Uosm was mesured with a freezing point osmometer (Roebling, Berlin, Germany) and urinary concentration of sodium and potassium by flame photometry (IL 943, Instrument Laboratory, USA). Urine urea concentration was measured with a standard kit (Urea Kit S 1000, BioMérieux, Lyon, France).
In each experiment, based on values obtained during the basal day, the rats were divided into several groups of equivalent urine volume and osmolality (n = 4 - 6/group) in order to test, during the experimental day, the effects of the different doses of hormones or drugs in groups of rats with equivalent urine concentrating activity. Usually, 3 or 4 independent experiments were performed in the same series of rats, at one-week interval (to allow washout from the preceding experiment). All animal procedures were conducted in accordance with the European guidelines for the care and use of laboratory animals.

Experimental protocols

V2R agonist dDAVP: dose-response curve (Experiment A)

dDAVP (1-desamino 8-D-arginine vasopressin) (Minirin, Ferring Pharmaceuticals AB, Malmö, Sweden) is a selective peptidic V2R agonist [61]. The dDAVP solution was emulsified in oil (1/9 vol/vol) in order to prolong its bioavailability, and injected s.c. (under the skin of the back of the neck) in 7 rat groups (600 µl emulsion/kg BW) at concentrations in the aqueous phase designed to deliver 0 (vehicle alone), 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, or 6 µg/kg BW (corresponding approximately to 0.02, 0.06, 0.2, 0.6, 2, or 6 nmol/kg BW).

V2R antagonist SR121463A: dose-response curve (Experiment B)

SR121463A (satavaptan, Sanofi-Aventis, Toulouse, France) is a selective non-peptide V2R antagonist with a relatively long half-life [62, 63]. On experimental day, the V2R antagonist dissolved in DMSO (10 % final volume) and saline, was injected i.p. (1 ml/kg BW) in 6 equivalent rat groups at various concentrations delivering 0 (vehicle alone), 0.01, 0.03, 0.1, 1, or 10 mg/kg BW. In this experiment, urine was collected not only for the first 6 h following the drug administration, but also, in separate tubes, for the following 18 h (i.e., from 6 to 24 h after the injection) so as to evaluate the delayed effects of the drug.

Natural AVP: dose-response curve (Experiment C)

Synthetic [Arg8]-vasopressin acetate salt (Sigma-Aldrich, Chemie, Steinheim, Germany), i.e., natural AVP, dissolved in saline, was emulsified in oil (1/9 vol/vol) and injected s.c., as described for dDAVP (600 µl emulsion/kg BW) in 5 groups of rats. The concentration of AVP in the aqueous phase was designed to deliver 0 (vehicle alone), 0.1, 1, 15 or 50 µg/kg BW (corresponding approximately to 0.1, 1, 15 or 50 nmol/kg BW). As in previous studies [54, 57], the dose range for AVP was about 5 times higher than that for dDAVP because of the faster degradation of AVP in vivo.

Natural AVP plus V1aR antagonist SR49059 (Experiment D)

In order to evaluate the role of V1aR in the response to the natural hormone AVP, rats of this series were administered AVP (15 µg/kg BW, same procedure as in Experiment C) without or with the concomitant administration of the selective non-peptide V1aR antagonist SR49059 (relcovaptan, Sanofi-Aventis, Toulouse, France) at a dose of 10 mg/kg BW, shown in previous studies to block the pressor response to AVP [64]. This drug was dissolved in DMSO and cremophor (each 10 % of final volume) and then in saline, and was injected i.p. (1 ml/kg BW). For comparison, additional rats received vehicle alone, the V1aR antagonist alone, AVP at a lower dose (3 µg/kg BW), or dDAVP (0.6 µg/kg BW).

Urinary AVP concentration in different situations (Experiment E)

In order to evaluate the concentration of AVP prevailing in the lumen of the CD in different situations, we performed additional experiments in which urine was collected for 6 h, as in the other experiments, under various experimental conditions including: injection of isotonic saline, injection of dDAVP 0.6 µg/kg BW, injection of AVP 3 or 15 µg/kg BW, 24 h dehydration. Urine volume and Uosm were measured and aliquots of urine were stored at -20°C for further AVP assay. UAVP was measured as previously described [65]. The antibody used does not recognize dDAVP.

Comparison of V2R antagonist and furosemide effects (Experiment F)

Classical diuretics and aquaretics (V2R antagonist) increase V by different mechanisms. In order to compare the respective effects of the two types of drugs on water and sodium excretion, we performed an additional experiment in which different groups of rats received either furosemide (Lasix, Sanofi-Aventis, France) or the V2R antagonist (prepared and injected as in Experiment B) at various doses (0, 0.1, 0.3, 1, 10 and 30 mg/kg BW for furosemide, and 0, 0.1, 0.3, 1 and 10 mg/kg BW for the V2R antagonist). Urine was collected for 6 h after the injections.

calculations and statistics

V and the excretion rate of the different solutes were calculated according to standard formulas. The TTKG, reflecting the intensity of potassium secretion, was calculated by dividing the urine/plasma potassium concentration ratio by the urine/plasma osmolality ratio [66]. Plasma osmolality was arbitrarily considered to be 300 mosm/kg H2O and plasma potassium concentration 5 mmol/L in all rats.
Results are expressed as means ± SEM. In Experiments A to D, each rat was its own control. Thus, for each variable, the ratio of the experimental day over the basal day provides a quantitative estimate of the changes induced by the hormone and/or drug. The statistical significance of these changes was evaluated by paired Student's t test comparing results of the experimental day to those of the basal day in each rat. In Experiment E, comparison between the different groups was performed by one-way ANOVA followed by Fisher post-hoc test. In Experiment F, linear regressions were calculated between the changes in sodium or potassium excretion and those in water excretion.
ACKNOWLEDGEMENTS
The authors thank Sanofi-Aventis for supplying the antagonists used in the experiments described in this paper.
The authors want to thank Claudine Serradeil-Le Gal (Sanofi-Aventis, Toulouse, France) for fruitful scientific discussions, and Marie-Françoise Arthus and Michèle Lonergan (Hôpital du Sacré-Coeur, Montréal, Canada) for AVP measurements.
Financial support for these studies was provided by the INSERM annual budget of Unit 872 (ex Unit 652 and 367) (France) (for LB) and by Canada Research Chair Program (Canada) (for DGB). JP received a fellowship of the French Society of Nephrology in 2006-2007.
This work was presented at the Annual Meeting of the American Society of Nephrology (2004) and published in abstract form in J Am Soc Nephrol, 16:87A, 2004.


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Table 1: Basal values observed on Day 1 in groups of rats used in the different experiments


Exp.

n

BW

(g)

V

(ml/h)

Uosm

(mosm/kg H2O)

Na excretion

(µmol/h)

K excretion

(µmol/h)

Urea excretion

(µmol/h)

TTKG

A

64

356

0.58 ± 0.02

1436 ± 51

57.5 ± 3.0

111 ± 4

431 ± 14

8.36 ± 0.13

B

35

281

0.48 ± 0.03

1723 ± 84

51.0 ± 3.7

124 ± 7

394 ± 20

9.34 ± 0.16

C

48

300

0.53 ± 0.03

1643 ± 74

71.5 ± 3.1

126 ± 5

385 ± 17

9.36 ± 0.14

D

70

285

0.60 ± 0.03

1609 ± 49

81.1 ± 4.3

133 ± 5

462 ± 20

9.02 ± 0.14

F

72

274

0.51 ± 0.02

1363 ± 52

51.8 ± 2.5

105 ± 4

387 ± 16

9.48 ± 0.13


Exp. = Experiment; n = number of rats; V = urine flow rate; Uosm = urine osmolality; TTKG = transtubular potassium gradient.
Table 2: Urinary AVP and other urinary characteristics in Experiment E


Treatment

n

V

(ml/h)

Uosm

(mosm/kg H2O)

Osm. excretion

(µosm/h)

UNa

(mmol/l)

Na excretion

(µmol/h)

UAVP

(pg/ml)

AVP excretion

(pg/h)

Vehicle

5

0.54 ± 0.06

1699 ± 150

921 ± 129

142 ± 37

75 ± 19

272 ± 102

149 ± 57

AVP-3

5

0.52 ± 0.06 C

2105 ± 141 c

1069 ± 103

195 ± 17 c

100 ± 12

7269 ± 1646

3489 ± 435

AVP-15

5

0.87 ± 0.09 A,B,C

1192 ± 61 b,C

1035 ± 113

204 ± 5

176 ± 15 A,B,C

29028 ± 7314 A,B,C

25275 ± 7891 A,B,C

24-h dehydr.

8

0.24 ± 0.02 A

2914 ± 213 A

702 ± 68

295 ± 25 A

71 ± 8

5329 ± 1072

1322 ± 220

dDAVP

5

0.31 ± 0.03 a

2461 ± 139 a

769 ± 114

172 ± 34 c

54 ± 12

269 ± 53

84 ± 19


n = number of rats per group; V = urine flow rate; Uosm = urine osmolality; Osm. = osmolar; UNa and UAVP = urinary sodium or AVP concentration; dehydr. = dehydration.

One way ANOVA followed by Fisher post hoc test were used to compare the different groups. Letters indicate the significance of the different comparisons as follows: a or A: comparison to the time-control group (vehicle); b or B, comparison to the AVP-3 group; c or C, comparison to the 24-h dehydrated group. Lower case letters: p < 0.01; capital letters: p < 0.001.



Figure 1. Dose-dependent effects of the V2R agonist (dDAVP) and the V2R antagonist (SR121463A) on fluid and solute excretion rates (Experiments A and B, n = 4-6 rats per dose). Results are expressed as ratios experimental day/basal day (Exp/Basal). Thin lines illustrate the dose-dependent effects. Paired t test, experimental vs. basal: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.


Figure 2. Dose-dependent effects of AVP on fluid and solute excretion rates (Experiment C, n = 4-6 rats per dose). Results are expressed as ratios experimental day/basal day (Exp/Basal). Thin lines illustrate the dose-dependent effects. Paired t test, experimental vs. basal: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.


Figure 3. Effects of AVP (15 µg/kg BW = AVP-15) on urine flow rate and osmolality and on sodium excretion rate without or with the co-administration of the V1aR antagonist (Experiment D, n = 4-6 rats per dose). The effects of the antagonist alone, and of dDAVP are also shown. Results of the experimental day are expressed as % of values observed during the basal day in the same rats. Paired t test, experimental vs. basal: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.



Figure 4. Dose-dependent effects of the V2R antagonist on urine flow rate and osmolality and on sodium excretion rate in the first 6 h after drug administration, in the following 18 h (6-24 h), and in the whole 24 h, during the experimental day (basal day not shown) (Experiment B, n = 4-6 rats per dose). Paired t test, experimental vs. basal: *, p < 0.05; **, p < 0.01; ***, p < 0.001.


Figure 5. Influence of the V2R antagonist (open circles and dotted line, n = 27) or furosemide (closed circles and solid line, n = 29) at different doses (0.1, 0.3, 1, 10 and 30 mg/kg BW for furosemide, and 0.1, 0.3, 1 and 10 mg/kg BW for the V2R antagonist) on sodium (top) and potassium (bottom) excretion rates as a function of the simultaneous changes in fluid excretion rate (= urine flow rate). Results are expressed as ratios experimental day/basal day (Exp/Basal) for each rat, and regression lines are shown. For both the abcissa and ordinate, a value of 1 means no change. The equations of the regression lines and corresponding correlation coefficients are as follows:

- for sodium with Furosemide y = 1.360 x - 0.54, r = 0.88, p < 0.001;

- for sodium with the V2R antagonist y = 0.189 x + 0.82, r = 0.82, p < 0.001;

- for potassium with Furosemide y = 0.099 x + 0.88, r = 0.45, p < 0.05;

- for potassium with the V2R antagonist y = 0.058 x + 0.86, r = 0.77, p < 0.001.

Figure 6. Schematic representation of the dose-dependent effects of AVP on sodium excretion rate, and dissociation of these effects into V2R- and V1aR-mediated responses. The abcissa represents increasing levels of plasma AVP from left (undetectable) to right. A corresponds to the lowest values of AVP which reduces urine flow rate but not sodium excretion rate. V2R antinatriuretic and V1aR natriuretic effects are depicted as sigmoid curves with different thresholds (B for V2R and C for V1aR effects). B' and C' correspond to the maximum effects depending on each receptor type, respectively. M corresponds to the value of plasma AVP for which the antinatriuretic and the natriuretic effects compensate each other. This value probably fluctuates according to a number of factors influencing the intensity of the responses mediated by each of the two receptor types.

1.3. Commentaires et discussion

1.3.1. Meilleure compréhension des effets de la vasopressine sur l’excrétion sodée


Cette étude nous a permis de mieux comprendre pourquoi, dans la littérature, les effets de la vasopressine sur l’excrétion sodée ne sont pas clairs : il faut tenir compte du niveau de l’hormone, très schématiquement divisé ici en trois situations simplifiées. De plus, les protocoles expérimentaux utilisés précédemment (anesthésie, forte hydratation) ont pu induire des facteurs de confusion.
- Situation n°1. Lorsque les taux circulants de vasopressine sont faibles, suite à une prise abondante de boisson par exemple, l’hormone n’a pas d’effet sur l’excrétion sodée.

---> effet antidiurétique très sensible à de faibles doses d’hormones, mais absence d’effet sur l’excrétion sodée
- Situation n°2. Comme nous l’avons déjà dit précédemment, il semble que des taux de vasopressine plus élevés soient nécessaires pour induire des effets V1a que des effets V2. Donc lorsque la vasopressine est sécrétée à des taux physiologiques modérés, l’effet antinatriurétique dépendant des récepteurs V2 se manifeste de façon dominante et masque le léger effet natriurétique dépendant des récepteurs V1a s’il commence à apparaître.

---> un effet antinatriurétique modéré accompagne l’effet antidiurétique
- Situation n°3. Pour des niveaux de vasopressine plasmatique très élevés (injection de vasopressine exogène par exemple), l’effet natriurétique des récepteurs V1a devient important, jusqu’à devenir majoritaire et masquer à son tour l’effet antinatriurétique des récepteurs V2.

---> effet natriurétique
Les divers effets de la vasopressine sur l’excrétion sodée observés dans la littérature semblent donc s’expliquer par des conditions expérimentales différentes, qui font intervenir des quantités variables d’hormone, et des protocoles très différents.
- Beaucoup de travaux sur la vasopressine commencent par une charge hydrique et/ou une perfusion de fluide hypotonique afin de supprimer la sécrétion de l’hormone endogène, pour ensuite voir les effets de vasopressine exogène. L’eau n’étant excrétée qu’avec un certain retard, cette hydratation fait augmenter la volémie dans des proportions extraphysiologiques, hausse aggravée ensuite par l’administration de vasopressine exogène. Cette hypervolémie peut avoir des conséquences notamment sur la diurèse et la natriurèse, indépendamment de l’action directe de la vasopressine.
- De nombreuses études sont réalisées sur des animaux anesthésiés et/ou opérés. Or, ce sont des interventions connues pour augmenter la sécrétion de vasopressine endogène.
- Dans certaines expériences, les quantités de vasopressine exogène utilisées sont trop importantes, ce qui ne permet pas l’étude des effets physiologiques de cette hormone. 

1.3.2. Avantages et limites de notre étude


  • L’urine a été recueillie sur des périodes assez courtes

Dans ces expériences, nous souhaitions étudier les effets précoces de la vasopressine sur l’excrétion sodée afin de s’affranchir de tout mécanisme compensateur éventuel. Des recueils d’urine de 6 h nous ont paru être le meilleur compromis entre une période d’étude assez courte et un volume d’urine suffisant pour 1°) faire les dosages et 2°) éviter des erreurs relatives trop importantes. Cette durée de recueil est appropriée aussi à l’utilisation d’agonistes et d’antagonistes à longue durée d’action. Mais nous ne pouvons pas exclure que, déjà dans ces six heures, des mécanismes compensateurs se manifestent.



  • Les rats sont dans des conditions les plus normales possibles

Notre protocole a l’avantage d’éviter les artéfacts liés à un préconditionnement non physiologique des animaux (pas d’anesthésie ni de chirurgie, aucune charge hydrique…). Les rats ont seulement été placés en cages à métabolisme, système qui permet de recueillir les urines sans perturber l’animal. Nous avons pris soin d’adapter les rats à ces cages plusieurs jours avant le début de chaque expérience, et, sauf indication contraire, ils avaient à leur disposition de l’eau et de la nourriture ad libitum. Mais le rat est un animal nocturne. Lorsque nous avons fait, le Jour, les injections des molécules à étudier, il s’agissait donc de la période de repos des rats, phase pendant laquelle ils ne s’alimentent quasiment pas. Il serait intéressant d’étudier les rats pendant leur période d’activité, mais notre animalerie ne permet pas de faire un cycle inversé d’éclairage.



  • Les rats sont répartis en groupes équivalents, dont un groupe contrôle

Il existe toujours de grandes différences d’osmolalité urinaire entre les rats, bien que leur origine, leur race, leur sexe, leur âge et leur nourriture soient les mêmes. Cette variabilité est notamment illustrée Figure 16 pour le jour Basal dans trois expériences de notre étude. Ainsi, afin de comparer le jour Expérimental les effets des différentes molécules sur des rats ayant une activité de concentration de l’urine équivalente, nous avons constitué des groupes de rats ayant un volume d’urine et une osmolalité urinaire équivalents pour le jour Basal. De plus, dans chaque expérience, chaque rat est son propre contrôle. Enfin, chaque expérience comprend un groupe contrôle : rats recevant les deux jours le solvant seul. Ceci permet de repérer toutes variations des paramètres urinaires d’un jour à l’autre non liées aux molécules injectées.



  • Les mécanismes et les organes impliqués restent inconnus

Dans cette étude, nous avons réussi à mieux caractériser les effets de la vasopressine sur l’excrétion sodée, mais à l’échelle de l’organisme entier. Notre protocole ne permet pas de déterminer les mécanismes intrarénaux responsables ni les organes éventuellement impliqués de façon indirecte dans les changements observés. Il n’est pas non plus possible de savoir s’il s’agit d’effets rénaux exclusivement ou également d’effets périphériques et/ou centraux de la vasopressine.



Figure 16 : Dispersion des valeurs d’osmolalité urinaire (Uosm) de 24 h des rats en conditions basales dans trois expériences différentes
Il existe dans nos expériences une différence d’osmolalité urinaire inter-rats d’environ un facteur 3 le jour Basal.

Chaque point représente un rat.


1.3.3. Applications envisageables chez l’Homme


  • Traitement de l’hypertension par un antagoniste des récepteurs V2 ?

Lorsque la vasopressine est sécrétée à des taux physiologiques, son action antidiurétique peut s’accompagner d’un effet antinatriurétique via ses récepteurs V2. Or, ce faible débit urinaire et ce retard dans l’excrétion du sodium entraînent une rétention sodée plus ou moins importante qui peut, dans certains cas, provoquer une augmentation de la pression artérielle. Plusieurs études ont notamment associé hypertension et effets V2 de la vasopressine :
- Des travaux chez le rat ont montré qu’une perfusion chronique de dDAVP fait augmenter la pression artérielle [37, 45, 66, 67] et aggrave l’intensité de l’hypertension due à l’administration de DOCA-sel (modèle expérimental d’hypertension sensible au sel provoqué par une perfusion chronique d’un analogue de l’aldostérone, l’acétate de déoxycorticostérone (DOCA) et associé à un apport sodé important) [37].
- D’autres études ont montré que l’administration chronique d’antagonistes des récepteurs V2 a prévenu l’augmentation de pression artérielle dans des modèles d’insuffisance rénale et/ou d’hypertension DOCA-sel chez le rat [71, 72].
Ainsi, les effets diurétiques et natriurétiques des antagonistes non peptidiques sélectifs des récepteurs V2 décrits dans notre article apportent des éléments nouveaux en faveur de l’idée qu’un traitement par un tel antagoniste pourrait être envisagé dans certaines formes d’hypertension, notamment dans les hypertensions sensibles au sel. Un protocole d’étude clinique, en collaboration avec le Professeur Jean-Pierre Fauvel (Service de Néphrologie, Hôpital Édouard Herriot, Lyon), est en préparation pour tester cette hypothèse.



  • Faut-il préférer un antagoniste mixte V1a/V2 ?

Malgré l’absence de données montrant un rôle majeur des récepteurs V1a dans l’hypertension en général, l’idée que ces récepteurs sont potentiellement hypertensifs par leurs effets vasoconstricteurs reste forte [25, 103]. De plus, comme l’administration d’un antagoniste des récepteurs V2 fait s’élever la sécrétion de vasopressine endogène, il semble logique d’associer un antagoniste V1a à l’antagoniste V2. Pourtant, le rein est beaucoup plus sensible à des taux faibles de vasopressine que ne l’est le système vasculaire. Donc, dans la vie courante, il semble y avoir une prépondérance des effets de la vasopressine sur le rein et peu d’effet au niveau vasculaire. Ainsi, les effets V1a, qui s’opposent aux effets V2 dans les cellules du CC (voir paragraphe 2.6. dans la partie ‘Introduction’), seraient plutôt bénéfiques dans le contrôle de la pression artérielle grâce à leur rôle atténuateur des effets V2 néfastes, en tout cas chez le rat (Figure 17). Il faudrait donc évaluer attentivement les conséquences d’une éventuelle association des antagonistes des récepteurs V1a et V2 chez l’Homme.


Figure 17 : Schéma récapitulatif des effets des récepteurs V1a et V2 rénaux et extra-rénaux sur la pression artérielle
NO: monoxyde d’azote
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