Concepts et Techniques








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Juillet 2003 n°208

Une version plus complète de ce bulletin est accessible sur le site de l'INRA www.inra.fr. sous son nom dans : Information Scientifique et Technique puis Publications INRA en ligne.

Le signe ### dans cette version papier indique quelques développements supplémentaires ou des commentaires additionnels consultables dans la version électronique. André BERKALOFF

e-mail : andre.berkaloff@igmors.u-psud.fr

Concepts et Techniques


1. On trouve chez la levure trois gènes codant des sous-unités de la protéine catalytique de la télomérase

La télomérase comprend une protéine catalytique qui est une réverse transcriptase associée à un ARN. Chez la levure et chez les Ciliés, la télomérase fonctionne en permanence, tandis que chez l'homme, par exemple, son activité est régulée et limitée aux tissus en fort renouvellement.

Chez Euplotes, deux sous-unités ont été identifiées. Deux des trois protéines caractérisées dans l'activité de la télomérase, Est1 et Est3 (Ever shorter telomers) sont des éléments régulateurs. La question est de savoir si ces protéines régulatrices se retrouvent chez les autres eucaryotes. V Lundblad; Current Biology 13 (13MAY03) R439-441 analyse un certain nombre d'articles traitant de ce sujet. La régulation positive par Est1 se retrouve partout. Il y en a même, trois versions chez l'homme dont deux, hEST1A et hEST1B (h pour human) sont effectivement associées à la régulation de la télomérase. Curieusement une surexpression de hEST1A entraîne une réduction des télomères et des fusions chromosomiques létales, mais cet effet est inversé en co-exprimant la sous-unité catalytique de la télomérase.

L'une de ces protéines EST1 humaines, non seulement participe à l'allongement des télomères, mais encore les protège ensuite. Ceci est également vrai pour Schizosaccharomyces cerevisiae.

Est1 de la levure sert probablement d'adaptateur entre la sous-unité catalytique et la protéine Cdc13 fixée sur le chromosome. Curieusement la télomérase est présente dans la chromatine télomérique, même quand elle est inactive, ce qui suggère qu'elle y est séquestrée dans la partie subtélomérique et rendue active uniquement à la fin de la phase S par recrutement par Est1 et Cdc13. Les trois Est1 humaines se partagent-elles les fonctions de l'Est1 de la levure?

On trouvera dans Z Karamysheva et al.; Cell 113 (30MAY03) 565-576, un article sur la reformation des télomères dans le macronucleus du Cilié Euplotes crassus. Un commentaire de G Cristofari et al.; p.552-554 complète cette analyse. Usuellement tout chromosome rompu donne lieu à une délétion terminale (faute de centromère) avec reconstruction de télomères, mais la cellule évite usuellement cette situation. Les coupures doubles-brins peuvent, en effet, être réparées par fusion non homologue bout à bout, soit par recombinaison homologue. Les Ciliés ont choisi, pour leur macronucléus, une fragmentation chromosomique avec amplification, ce qui suppose une reconstitution de néo-télomères. Ils utilisent, pour ce faire, des isoformes de la réverse transcriptase de la télomérase, comme cela vient d'être montré. Euplotes possède trois gènes de cette TERT (TElomerase Reverse Transcriptase) avec des patrons d'expression différents. TERT-2 n'est exprimé que lors de la formation du macronucléus. L'activation de son gène est assurée par l'excision d'un ADN non codant qui interrompt la séquence dans la version micronucleus. Quand le macronucléus est complet le gène est éliminé.

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2.On trouvera dans J Zhang; Trends in Ecology & Evolution 18 (JUN03) 292-298, une revue sur l'évolution des gènes dupliqués, basée sur les travaux de l'auteur, mais les plaçant dans un cadre général. Ce n'est évidemment pas la première revue sur le sujet depuis la livre de S Ohno "Evolution by Gene Duplication, Springer (1970)", mais on y trouve des données intéressantes, car on dispose maintenant de nombreuses données de séquences génomiques plus ou moins complètes, qui permettent de donner un support aux cogitations théoriques.

Ces duplications résultent de crossing-over inégaux qui engendrent des duplications plus ou moins complètes avec maintien des introns en tandem et de rétrotranspositions qui se traduisent par des insertions plus ou moins au hasard avec disparition des introns et des séquences régulatrices. Les duplications par rétrotransposition ne peuvent englober plusieurs gènes adjacents et, dépourvues de séquences régulatrices, ne peuvent être exprimées, sauf dans les cas où le hasard fait que l'insertion est placée en aval d'un promoteur. Elles donnent immédiatement un pseudogène (non exprimé et libre, de ce fait, d'évoluer sans contraintes). .

Ces duplications donnant ce que l'on appelle des gènes paralogues, ont une fréquence très variable, ce qui indique que leur prolifération est probablement sélectionnée. Car il faut réaliser que la multiplicité des gènes des immunoglobulines (avec des dizaines de gènes) ou des récepteurs olfactifs en constituent des exemples extrêmes.

Le millier de gènes de récepteurs olfactifs est un exemple intéressant, car si la souris possède le même nombre de gènes de ces récepteurs que l'homme (et probablement les autres mammifères), 60% d'entre eux ont dégénéré en pseudogènes chez l'homme, alors que ce n'est le cas que de 20% d'entre eux chez la souris, dont l'olfaction est un des sens primordiaux, contrairement à ce qui s'est passé chez l'homme.

Ceci permet d'aborder le sort de ces duplications au cours de l'évolution.

On a calculé qu'une duplication est stabilisée (on dit fixée) fonctionnellement tous les 100 millions d'années chez les eucaryotes, de la levure à l'homme. La stabilisation d'un gène dupliqué dépend de la sélection appliquée. Naissance et mort d'un tel gène sont, certes, un évènement fréquent, mais la survie dépend de la pression de sélection pour la fonction assurée. La plupart du temps il y a pseudogénisation, avec accumulation de mutations diverses amenant la séquence au stade de séquence toute faite de réserve, utilisée ou pas et, si elle ne l'est pas, devenant de plus en plus aléatoire et donc neutre sur le plan évolutif. Il existerait ainsi un pseudogène pour deux gènes fonctionnels dans le génome humain. Un gène dupliqué devient un pseudogène dans les quelques premiers millions d'années suivant la duplication.

Il arrive, cependant, qu'un pseudogène puisse assurer une fonction. Il existe un seul gène fonctionnel de chaîne lourde variable d'immunoglobulines chez le poulet. La diversité des immunoglobulines est alors assurée par conversion génique à partir des pseudogènes situés en amont de ce gène. Les pseudogènes servent donc de réserve génétique, bien qu'ils ne soient plus fonctionnels. La variabilité utilisée est donc celle libérée par la pseudogénisation (qui n'est pas contrainte du fait que les gènes ne sont pas exprimés).

Le gène de la ribonucléase pancréatique des ruminants a subi une duplication qui a eu lieu avant la diversification des ruminants, il y a 35 millions d'années. Or, chez les bovins, le gène dupliqué est exprimé dans la semence et l'enzyme est fonctionnelle, alors que, chez les autres ruminants, elle est non fonctionnelle, ou le gène n'est plus exprimé. Ceci indique que la séquence a très longtemps été conservée sous la forme d'un pseudogène avant de récupérer sa fonction chez les bovins pour une raison inconnue.

La conservation des deux gènes issus de la duplication peut être sélectionnée dans le cas de produits géniques nécessaires en abondance. Ce sont souvent des duplications par conversion génique (il faut une conservation des séquences régulatrices et des introns) qui sont à l'origine de ces duplications. Ils sont alors soumis à une évolution concertée des séquences, et une purification par sélection évite, surtout, les divergences.

Une autre issue possible est la subfonctionnalisation. Pas mal de protéines ont une double fonction ou une double localisation de l'expression, l'une majeure, l'autre secondaire. Une divergence entre les deux copies permet d'amplifier cette différence car la redondance laisse de la marge aux variations des séquences. C'est le cas pour les gènes dupliqués engrailed-1 et engrailed-1b du poisson-zèbre. Il en existe un seul orthologue chez la souris avec engrailed-1. Le gène unique de la souris est exprimé dans les bourgeons des membres et dans le système nerveux central, alors que ces deux localisations sont distribuées entre les deux gènes des poissons osseux.

Un exemple de divergence dans la fonction (issu des travaux de l'auteur) est celui des singes colobidés. Ces singes se nourrissent de feuilles, alors que les autres singes sont consommateurs de fruits ou d'insectes. Ce sont des "ruminants", qui consomment en réalité les bactéries qui fermentent les feuilles. Ils possèdent, en effet, une sorte de panse antérieure. Comme chez les ruminants, ils produisent beaucoup de ribonucléase pancréatique (permettant de bien recycler l'azote des acides nucléiques). Le gène de la RNase1 est dupliqué en RNase1B chez le Colobe asiatique Pygathrix nemaeus. (voir J Zhang et al.; Nature Genetics 30 (APR02) 411–415. Le gène de la RNase1B a évolué beaucoup plus rapidement que celui de la RNase1, les substitutions non synonymes (donnant donner un acide aminé différent) sont, en effet, beaucoup plus nombreuses dans ce gène que dans sa copie originale persistante. Reste à expliquer la persistance d'une duplication fonctionnelle. Ce n'est pas une redondance parfaite qui a été sélectionnée, mais une adaptation au pH intestinal relativement acide (pH6,3) de ce colobe (alors que celui d'un singe Rhésus est de 7,4 à 8) ou la RNase1B est six fois plus active que la RNase1, alors que le pH opt est le même avec 7,4 pour les deux RNases. Par ailleurs, la RNase1 a une autre fonction, mineure, qui est celle d'une RNase double brin. Cette fonction est déprimée de 300 fois pour la RNase 1B. Il y a donc une adaptation et une spécialisation des deux gènes dupliqués.

On retrouve cette spécialisation dans les deux opsines rétiniennes des primates du Vieux Monde permettant la perception du rouge et du vert liée à deux substitutions. Mais ces "néofonctionnalisations" peuvent comporter de très nombreuses substitutions et l'on peut se demander quelle a été la fonction de la protéine entre temps, pour qu'elle ait été conservée.

L'auteur traite ensuite des forces qui sont derrière ces modifications géniques. La sélection est évidente quand on observe nettement plus de mutations non synonymes que de synonymes après la duplication. La divergence peut résulter de l'apparition d'une nouvelle fonction, faible mais utile, qui est alors l'objet d'une sélection positive. Elle peut résulter également de l'amélioration d'une fonction secondaire préexistante, qui devient primaire dans un des deux gènes.

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3.### Un article de chercheurs du TIGR (The Institute for Genomic Research) discute des apports respectifs de la "génomique " et des données de l'évolution: JA Eisen et al.; Science 300 (13JUN03) 1706-1707.

On commence, en effet, à réaliser comment similitudes et différences entre génomes ont pris naissance et quand elles sont apparues. Ces études sont très souvent rendues possibles uniquement quand la séquence complète du génome est connue et inversement certaines études génomiques sont facilitées par les données évolutives. L'intégration des deux approches est suggérée par les auteurs

C'est ainsi que l'on pu montrer que les bactéries hyperthermophiles sont probablement apparues récemment, que les Microsporidies sont en réalité des champignons, et non des protistes très anciens.

Les ramifications de l'arbre évolutif peuvent être utilisées en génomique si l'arbre est solide. Cet arbre permet de sélectionner l'espèce qui est la mieux adaptée à une question donnée. Drosophila pseudoobscura a été choisie pour un séquençage total, car elle est relativement éloignée de D.melanogaster, mais permet de repérer les régions régulatrices qui doivent être relativement conservées. L'arbre évolutif permet, par ailleurs, de sélectionner des espèces encadrant les grandes transitions évolutives majeures. Ainsi des génomes situé de part et d'autre de la transition Pro-Eucaryotes ont permis d'identifier des structures géniques absentes des procaryotes et conservés au sein des eucaryotes. Les auteurs pensent, ainsi, qu'il serait intéressant de séquencer un Monotrème (ces premiers Mammifères comme l'Echidné Echidna hystrix ou setosa, ou le platypus Ornithorhynchus paradoxus)

Les transferts dits latéraux viennent parfois perturber la nature ramifiée des arbres phylogénétiques. Leur existence a bien été confirmée par les séquençages complets. C'est en particulier, le cas des îlots de pathogénicité chez les bactéries et surtout des transferts géniques entre organites (mitochondries et chloroplastes) et noyau de leurs cellules hôte (plantes ou Plasmodium). Il faut cependant se méfier, car de nombreuses anomalies ont été expliquées un peu vite par ces transferts latéraux. C'est ainsi que l'on a crû déceler des centaines de gènes bactériens chez l'homme en 2001, ce qui a été réfuté par au moins trois publications subséquentes dès la même année. En réalité il est souvent difficile d'identifier de tels transferts dans les nombreuses anomalies de distribution, et ils sont probablement rares et ils n'ont probablement pas beaucoup modifié les arbres.

L'utilité de la phylogénie pour la prédiction de fonctions est notée. Les auteurs reprennent l'exemple des duplications totales ou segmentaires. L'âge des duplications est un indice, des duplications récentes sont souvent liées à un renforcement fonctionnel, tandis que des duplications anciennes donnent lieu, le plus souvent, à une divergence (voir §précédent).

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5.### Les protéines destinées au noyau portent un signal de ciblage (NLS) correspondant. Elles se lient à un hétérodimère des importines (alias caryophérines) et . L'importine reconnaît et lie la NLS, tandis que l'importine transporte le complexe à travers le pore nucléaire. La petite GTPase Ran, qui régule les interactions entre les récepteurs nucléaires et le fret introduit, assure la directionnalité du transport. Ran dissocie l'importine du complexe. Le complexe est alors réduit à la charge fixée sur l'importine  par la NLS. Les transporteurs sont ensuite recyclés vers le cytoplasme.

Il existe, dans la partie N-terminale de l'importine liant l'importine (IBB), une séquence auto-inhibitrice conservée sur le plan évolutif qui régule la fixation de la protéine par la NLS grâce à une obstruction intramoléculaire. MT Harreman et al.; Journal of Biological Chemistry 278 (13JUN03) 21361-21369.

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6. Des chercheurs du Memorial Sloan-Kettering Cancer Center montrent que les SNAREs (Soluble N-ethylmaleimide–sensitive factor Attachment protein REceptors) qui ont été évoquée à propos de la fusion des membranes intracellulaires par interaction entre une protéine de la vésicule (v-SNARE) et de la cible (t-SNARE) permettent les fusions inter-cellulaires. C Hu et al.; Science 300 (13JUN03) 1745-1749.

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