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partagés par plusieurs voies, alors que d'autres sont spécifiques d'une voie donnée. La revue traite des cas où ces voies ont également une fonction dans une plante saine. C'est le cas de la protéine TIP49a d'Arabidopsis qui interagit avec les protéines RPM1 et RPP5 et qui est homologue de protéines reconnaissant la "TATA box" intervenant dans la transcription, et module des voies signalisatrices variées. TIP49a est un régulateur négatif des voies de résistance RPP2 et RPP5. Elle est, par ailleurs, impliquée dans l'établissement des méristèmes et dans la viabilité des organes reproducteurs femelles. Ceci entraîne des difficultés pour identifier les mutants de résistance et donc l'analyse de celles-ci.

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23### La fonction de la protéine RIN4 d'Arabidopsis n'est pas connue, car des mutations n'ont guère de phénotype perceptible. Ce qui est intéressant c'est que l'on vient de montrer que cette protéine est modifiée par Pseudomonas syringae et c'est cette modification (probablement une phosphorylation) qui est perçue comme alerte par au moins deux autres protéines de la plante (RPM1 et RPS2) qui déclenchent les défenses. Une mise au point, basée sur les articles de MJ Axtell et al.; Cell 112 (07FEB03) 369-377 du groupe de StaskawiczMackey et al.;p.379-389 et D Mackey et al.; Cell 108 (22MAR02) 743-754, de celui de Dangl, est parue avec J Ellis et al.; Current Biology 13 (13MAY03) R400-R402.

RIN4 est manifestement un régulateur négatif de l'activité mortifère de RPS2 et l'apoptose est déclenchée quand le niveau de RIN4 baisse.

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24. Une revue de JE Parker; Trends in Plant Science 8 (JUN03) 245-247, compare le système d'immunité innée des animaux à certaines défenses des plantes. Je rappelle que ces défenses innées non spécifiques permettent de reconnaître, a priori, des motifs généraux à la surface des pathogènes, plutôt que des motifs spécifiques d'un pathogène donné. L'existence de mutants de plantes "immunodéprimées" indique l'existence possible de telles reconnaissances larges. Plusieurs motifs moléculaires perçus comme dangereux par les animaux, comme les lipopolysaccharides ou des fragments des flagellines bactériennes, constituent, comme chez les animaux,de puissants éliciteurs des défenses chez les plantes.

Un composant essentiel de la perception du fragment Flg22 de la flagelline, FLS2 d'Arabidopsis, est une kinase Receptor-Like (RLK) à domaine récepteur extra-cellulaire porteur de répétitions riches en leucines (LRR), et un domaine cytoplasmique sérine–thréonine kinase. FLS2 ressemble au récepteur Toll-Like 5 (TLR5), mais aussi aux protéines R de résistance spécifique comme Xa21 du riz, ainsi qu'aux protéines RLKs de plantes surveillant les signaux hormonaux et de symbiose. On devrait en trouver d'autres.

On peut, d'ailleurs, lire une autre revue plus ancienne de T Nurnberger et al.; Current Opinion in Plant Biology 5 (AUG02) 318-324 qui aborde également ce sujet (discuté dans le Bulletin d'Octobre-Novembre 2002 §23). La revue discute, en effet, une publication du groupe de Halle (F Brunner et al.; The EMBO Journal 21 (16DEC02) 6681–6688) où les auteurs place dans ces motifs généraux un des éliciteurs classiques, Pep-13 de Phytophthora sojae. C'est un fragment interne de la glycoprotéine de paroi GP42 qui est un motif présent dans les transglutaminases Ca2+-dépendantes de tous les Phytophtora. Ces transglutaminases ne ressemblent à aucune autre, et le motif en fait un indicateur de Phytophtora, car elles ne se retrouvent chez aucune plante, ni chez les Peronospora, ni chez les Pythium. Ce motif est situé sur une boucle à la surface de la molécule et serait donc facilement reconnaissable par un récepteur. Ce qui est intéressant est que toute mutation de ce motif entraîne une suppression de la fonction enzymatique ce qui explique sa stabilité et, par conséquent, sa validité dans un grand nombre de Phytophtora. Il est, en particulier, reconnu par la pomme de terre dans Phytophtora infestans.

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25. On trouvera dans BM Tyler; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 137-167, une revue sur la reconnaissance, au niveau moléculaire, des Phytophtora par leurs hôtes et vice versa. Il n'y a, pour l'instant, aucune étude un tant soit peu exhaustive des échanges de signaux et des cascades en aval.

Les Phytophthora comme les Pythium, Peronospora, Plasmopara sont des oomycètes, distincts des champignons et plutôt voisins des algues brunes et des diatomées au sein des Straménopiles. Les 60 espèces de Phytophtora sont toutes des pathogènes d'un grand nombre de plantes. Ils reconnaissent leurs hôtes et les déplacements de leurs zoospores sont orientés.

P. cinnamomi, P. parasitica (alias P. nicotianae) et P. cactorum attaquent des centaines d'espèces de plantes. D'autres comme P.sojae (alias Phytophthora megasperma f.sp. glycinea) et P.infestans ont, au contraire un spectre d'hôte très réduit. Ce dernier ayant été la cause de la famine irlandaise du 19° siècle, et il est à nouveau préoccupant.

P.sojae continue, lui, à être une préoccupation dans toutes les régions de culture du soja.

Les Phytophthora pousse sur la forme de cœnocytes hétérotrophes et saprophytes. Les zoospores aquatiques se déplacent avec deux flagelles et sont donc facilement dispersées par une irrigation un peu trop poussée. Elles ne vivent que quelques heures et donnent des cystes adhésifs qui germent pour donner des hyphes.

Les zoospores peuvent subir plusieurs réincarnations avec formations de sporanges puis libération de zoospores secondaires. Ceci leur laisse le temps de trouver un hôte en se guidant sur des molécules émises par ce dernier. Phytophthora comme Pythium reconnaissent des attracteurs peu spécifiques comme les acides aminés, etc… mais aussi l'éthanol émis par les racines en anaérobiose, conditions dans lesquelles elles se trouvent en sol saturé d'eau nécessaire au déplacement des zoospores. Cette faible spécificité est valable pour beaucoup de ces oomycètes, mais pas pour les spécialistes. Ainsi ce sont les isovaléraldéhyde, valéraldéhyde et ante-isovaléaldéhyde qui sont de forts chimioattractants pour les zoospores de P. palmivora.

Le cas le mieux analysé est celui des zoospores de P.sojae attirés par les isoflavones bien connues daidzéine et génistéine qui sont présents dans les graines de soja et exsudées par les racines et qui sont attractives jusqu'à moins de 1 nM. On a pu montrer que la méthylation du 4'-hydroxy trouvées chez beaucoup d'autres légumineuses diminue fortement l'attraction pour les zoospores de P.sojae. une autre chimioattraction intéressante est celles des zoospores vers les zoospores déja enkystées , c'est-à-dire vers un lieu déjà reconnu comme confortable.

Une autre attraction est électrique car les zoospores sont sensibles à des gradients de l'ordre de 0,5V/m. On dit que c'est une façon de distinguer les racines vivantes de celles qui sont mortes.

Il existe également un tropisme des hyphes après germination des kystes. Mais c'est surtout un thigmotropisme qui attire les hyphes qui adhèrent à la surface végétale et pénètrent entre les cellules. Aussitôt après le franchissement, la tendance s'inverse, et les hyphes fuient l'adhérence, éventuellement contre un gradient d'isoflavones attractives.

Une seconde partie de la revue envisage l'aspect plus classique de la reconnaissance de l'agresseur par la plante avec les gènes R de la plante et avr du pathogène.

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26.### La lutte contre les nématodes phytopathogènes n'est pas facile depuis l'interdiction d'un certain nombre de substances nématicides de synthèse comme les carbamates et organophosphorés. On recherche donc des substances naturelles actives issues des plantes. On en a évidemment trouvé pas mal, les plantes ayant eu à lutter contre ces pestes depuis fort longtemps. Mais, pour l'instant, rien n'est défendable économiquement. Il est clair que toutes ces substances phytochimiques sont probablement moins toxiques pour l'homme, mais certainement pas toutes, ce qui va également nécessiter des essais, même si on est plus tolérant pour ces substances que pour des molécules entièrement artificielles.

La recherche de substances nématotoxiques ou qui leur sont désagréables est largement pratiquée, mais de façon relativement empirique. Les produits sont tellement éphémères que l'on n'a même pas le temps d'évaluer leur efficacité. Un exemple de cocktail empirique commercialisé est celui de la Sincocin™ d'AgriScience composé d'extraits d'Opuntia, Quercus falcata, Rhus aromatica(un des sumacs, anacardiacée) et Rhizophora mangle (le palétuvier des mangroves). Une revue sur de type de lutte par des substances d'origine végétale est parue avec DJ Chitwood; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 221-249. Elle est consacrée, non seulement aux produits nématicides issus de plantes, mais encore des champignons

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27. On a admis longtemps que la systémine est le message envoyé dans toute la plante après une agression par un herbivore, signal qui provoque la production d'inhibiteurs de protéases. C'est un peptide de 18 amino-acides issu d'un clivage du précurseur prosystémine, et diffusé dans la plante par le phloème. La systémine est perçue par le récepteur kinase à répétitions riches en leucines (LRR) SR160 de Lycopersicum peruvianum introgressé par la sélection classique chez la tomate cultivée (voir J Scheer et al.;Proceedings of the National Academy of Sciences USA 99 (09JUL02) 9585–9590). Le récepteur serait d'ailleurs bien le même que celui des brassinostéroïdes (BRI1), comme l'indiquent T Montoya et al.; The Plant Cell 14 (DEC02) 3163-3176 et M Szekeres; Trends Plant Sciences 8( (MAR03) 102-104.

Des publications de l'an passé analysées dans la revue de JW Stratmann; Trends in Plant Science 8 (JUN03) 247-250, et basées sur les résultats de greffes diverses, montrent que la systémine est bien impliquée, mais comme signal à courte distance, contrairement à l'acide jasmonique qui opère à longues distances. La systémine interviendrait dans la transmission du signal jasmonique dans les feuilles indemnes.

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28.### La sous-unité  d'une protéine G hétérotrimérique (impliquée dans la transmission de signaux) de Fusarium oxysporum régule, comme FGA1, le développement et la pathogénicité de ce champignon, comme on l'avait déjà montré chez Cryphonectria parasitica. Le gène en a été cloné et sa fonction vérifiée par S Jain et al.; Current Genetics 423 (MAY03) 79-86.

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29. Seule la synthèse de trichothécène (désoxyvalénol) est associée, jusqu'à présent, à la pathogénicité sur blé de Fusarium graminearum. Ce champignon infecte l'épillet du blé et détruit les anthères durant la courte période entre floraison et début du remplissage des grains. De plus la production du tricothécène polluent les grains qui survivent et les rend inaptes à la commercialisation. Le gène de la trichodiène synthase qui catalyse la première réaction dédiée de la voie a été interrompu, ce qui réduit fortement la virulence du champignon. NJ Jenczmionka et al.; Current Genetics 423 (MAY03) 87-95.

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30.### Les antibiotiques les plus utilisés sur les plantes aux Etats-Unis sont l'oxytétracycline et la streptomycine. On utilise les antibiotiques pour soigner les plantes depuis 45 ans. Aux Etats-Unis, toujours, 25% des pommes, 40% des poires et 8% des pêches sont protégées par ce moyen. C'est l'usage principal des antibiotiques dans ce domaine. Cela ne constitue, cependant, que 0.5% de l'utilisation totale des antibiotiques (on a utilisé 8,7 tonnes de streptomycine et 7,5 tonnes d'oxytétracycline en 1997). La résistance à l'oxytétracycline est rare, mais si la streptomycine tue les bactéries sensibles, l'oxytétracycline n'est qu'un bactériostatique sur E.amylovora, et on la complémente par de la gentamicine au Mexique sur poiriers et pommiers et en Amérique Latine sur produits maraîchers.

Par contre des résistances à la streptomycine sont apparues chez Erwinia amylovora, Pseudomonas spp. et Xanthomonas campestris dès 1990, et on utilise donc, sur "feu" bactérien, une quinolone, l'acide oxolinique en Israel. Ces résistances se développent à la suite de transferts génétiques, mais par des éléments qui ne sont pas communs avec ceux des mêmes résistances chez les animaux. Cela n'empêche pas un débat sur leur utilisation, notamment sur les incidences sur la santé humaine de l'usage en agriculture. Une revue sur le sujet est parue avec PS McManus et al.; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 443-465.

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31. Closterovirus et Ampelovirus ont des génomes monopartites transmis par des pucerons pseudococcidés (mealy bugs), tandis que les Crinivirus (jaunisse infectieuse de la laitue par exemple) sont bipartites et transmis par des aleurodes (Whiteflies).

Le Citrus tristeza virus (CTV) des agrumes est un Closterovirus transmis par les greffes et par les aphides et qui peut persister aussi longtemps que l'arbre qu'il infecte (parfois une centaine d'années). Ce virus possède des formes défectives dont la plupart sont courtes (2–5 kb) avec des extrémités conservées encadrant de grandes délétions. On trouve quelques formes plus longues (~12 kb) retenant quelques ORFs et ressemblant beaucoup au RNA1 des Crinivirus. On vient de montrer qu'il existe également des formes analogues au RNA2 de ces virus avec une dizaine d'ORFs aval du génome. X Che et al.; Virology 310 (05JUN03) 298-309. Ces formes sont issues d'un recombinaison ARN, mécanisme qui n'est connu que depuis une vingtaine d'années. On comprend donc mieux l'origine des formes mono et bipartites.

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Les Plantes recombinantes

32. Une revue sur l'utilisation des plantes pour la production de protéines recombinantes thérapeutiques grâce des vecteurs viraux est publiée par des chercheurs de Large Scale Biology: GP Pogue et al.; Annual Review of Phytopathology 40 (SEP02) 45-74.

Les systèmes eucaryotes de production de telles protéines recombinantes sont préférés aux procaryotiques pour des raisons de modifications post-transcriptionnelles plus adaptées à leur usage. On utilise actuellement des lignées de cellules CHO (Chinese Hamster Ovary) d'insectes ou des levures.

Le coût de fonctionnement de ces bioréacteurs pousse à des recherches d'économies dont les plantes peuvent profiter, à côté des animaux transgéniques actuellement en lice. Cela crée de nouvelles contraintes qui doivent être envisagées.

Il existe deux stratégies dans ce domaine avec, soit des plantes transgéniques, soit des expressions transitoires avec des vecteurs viraux. Les auteurs s'intéressent plus spécialement aux vecteurs viraux à ARN (+), c'est-à-dire directement codant.

La production de plantes transgéniques nécessite une longue période de mise au point de semences génétiquement stables et débarrassées des problèmes de "silencing" et se prêtant facilement à un confinement génétique.

On sait, par contre, facilement obtenir, avec une infection virale, une très forte expression, difficile à obtenir avec des plantes transgéniques. Le montage des vecteurs est l'affaire de quelques semaines seulement. Les méthodes d'extraction ("illustrées" par les auteurs par deux brevets qui n'ont que peu de choses à voir avec le sujet, mais qui sont ceux de leur firme) sont déjà assez largement diversifiées, mais on doit garantir l'absence de contaminations par des molécules toxiques de la plante.

Les premiers vecteurs étaient des vecteurs à remplacements. Le transgène souhaité remplace un gène viral, de sorte que, ou bien il ne peut même pas passer d'une cellule à l'autre, du fait du remplacement de la protéine de capside [cas de bromovirus avec remplacement de la protéine de capside (CP)], soit il ne pouvaient se disséminer dans la plante, cas du même montage avec le virus de la mosaïque du tabac (TMV).

On est rapidement passé à des vecteurs d'addition aux gènes normaux, ou de fusion avec l'une des protéines virales. On prend alors la précaution d'ajouter une séquence permettant le clivage ultérieur de la protéine de fusion. On a ainsi créé des vecteurs à partir des poty- et clostérovirus où on insère le transgène dans la séquence de la polyprotéine virale.

De tels virus nécessitent souvent, de par leur nature, des promoteurs subgénomiques (le virus (+) doit se répliquer en formes subgénomiques) qui sont autant d'occasion d'excision par recombinaison, ce qui crée une instabilité (qui peut être souhaitée pour des raisons de sécurité génétique). Une autre source d'instabilité est la simple charge par un transgène qui cause un handicap pour la réplication des séquences plus longues du fait de l'insertion du transgène (un ajout de 200 nucléotides est déja perceptible de ce point de vue).

Les vecteurs utilisés ont, chacun, leurs contraintes. Ainsi les virus en bâtonnets comme le TMV sont plus tolérants pour la taille de l'insert qu'un virus sphérique (icosaédrique) pour des raisons stériques faciles à comprendre.

Les virus utilisés cités dans la littérature sont le TMV, le virus X de la pomme de terre, le Plum Pox virus, le Zucchini Yellow Mosaic Virus, le Clover Yellow Vein Virus ainsi que le Tobacco Etch Virus.

Il est évident que la production de vaccins oraux est envisagée dans de nombreuses équipes et ce Bulletin en a fait état (voir, par exemple, la revue de A Mercenier et al.; Current Opinion in Biotechnology 12 (OCT01) 510 515). Cette production aboutit, soit à un antigène libre, soit une protéine de fusion avec la protéine de capside. Mais certains peptides de fusion sont très mal tolérés par la plante. D'autres ont peu d'effet sur la plante, mais entraînent des malformations de la protéine de capside qui handicape l'effet amplificateur indispensable du virus vecteur. Une astuce intéressante pour tourner cette dernière difficulté est d'utiliser des codons stop "leaky" entraînant des proportions variables de protéine de fusion et de protéine de capside en bonne et due forme. D'ailleurs des capsides mosaïques sont fortement immunogènes, ce qui est un plus. D'une façon générale, et c'est également valable pour les immunogènes solubles issus de plantes, les agrégats relativement impurs sont plus efficaces que les immunogènes purs.

Les exigences d'une production dans les plantes sont analysées par les auteurs. Ils mentionne la stabilité du transgène évoquée plus haut. Cette stabilité doit être maintenue dans les stocks importants de virus recombinant indispensables à la production dans les plantes. Or les virus à ARN sont congénitalement mutateurs n'ayant, apparemment, pas de systèmes de vérification des copies. On constate, cependant, que des passages successifs dans des plantes ne modifient pas substantiellement les séquences non virales. Il faut, également, que l'expression résiste aux stress inévitablement subis par la culture et aux défenses de la plante qui n'aime pas les ARNs doubles-brins.

Les plantes choisies dépendent de la compétence de la compagnie qui veut les utiliser. Une plante très favorable, car elle est très sensible à toutes sortes de virus, est Nicotiana benthamiana. Malheureusement, revers de la médaille, c'est une plante tellement sensible à toutes les agressions qu'il faut la cultiver en serres. Les génotypes des plantes inoculées doivent être sélectionnés pour une utilisation donnée, mais ces données ne se retrouveront pas de sitôt dans une publication.

L'inoculation à la main des plantes productrices est faisable jusqu'à 1000 pieds, mais au-delà il faut mécaniser l'opération. Large Scale Biology utilise une injection sous pression. Un hectare peut être inoculé à 90% par six personnes en une heure avec des injecteurs multiples sur tracteur.

Les problèmes de sécurité pour une utilisation orale doivent prendre en compte le fait que le virus, mais également le transgène peuvent modifier le métabolisme de la plante.

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