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Les Productions Microbiennes


74.### Le groupe de Taddei a, depuis quelques temps, défendu avec brio l'idée que les stress stimulent les mutations, rendant les bactéries plus adaptables. Des cultures bactériennes exposées à un stress entraînant un blocage de la multiplication comme des carences, multiplient les mutations. On a dénommé ce phénomène: mutations "adaptatives", "de phase stationnaire" ou "inductibles par stress". Mais, jusqu'à présent, les études ont été effectuées sur l'Escherichia coli des laboratoires, et la levure de bière, bêtes de somme de la génétique microbienne, et donc bien connues. Il était d'ailleurs judicieux de commencer par là. Mais les souches de laboratoire sont beaucoup plus homogènes que leurs congénères en liberté. Aussi fallait-il élargir les analyses aux souches naturelles pour confirmer la généralité du phénomène. C'est ce qu'on fait I Bjedov et al.; Science (31MAY03) 1404-1409. Voir également le commentaire clair de SM Rosenberg et al.; p.1382-1383.

Dans les cas les mieux analysés, il y a autant de mutations inutiles ou négatives, que de favorables. Ce qui émerge est que divers mécanismes contribuent à ces mutations et que certains sont différents de ceux rencontrés dans des cellules dites" en croissance". Chacun des mécanismes fait intervenir dans la mutagenèse une ADN polymérase différente parmi les cinq existant chez E.coli, les polymérases à haute fidélité I ou II, ou la polymérase désinvolte Pol IV.

Mais l'activité est élevée non seulement aux sites endommagés, mais encore partout dans le génome d'où l'effet mutagène (on parle de mutagenèse non ciblée). On a donc considéré ce phénomène comme un effet gratuit et inconsidéré d'une modification de l'appareil de réplication. `

L'une des questions importantes est de savoir si ce sont les mécanismes qui ont été sélectionnés pour conférer une adaptabilité supérieure, ou si ce sont les mutations elles mêmes (et seules) qui sont sélectionnées.

Le groupe de Taddei montre que la grande majorité des souches naturelles, et ils en ont analysé 787 du monde entier et de tous les milieux, présentent ce mécanisme en réponse à une carence nutritionnelle ou oxydative. Ils soulignent, d'autre part, que le mécanisme diffère d'une bactérie à l'autre. L'importance de la réponse dépend de la niche écologique, plus que la phylogénie des souches au sein des E.coli.

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75.### Un certain nombre de sucres sont les sources de carbone préférées de Saccharomyces cerevisiae, qui peut également utiliser les substrats non fermentescibles comme éthanol, glycérol, lactate, acétate ou oléate. La préférence pour le glucose appelée répression catabolique intervient dans la synthèse coordonnée des enzymes de l'utilisation non fermentescible.

On a mis en évidence une série de complexes stimulateurs ou répresseurs agissant sur ces voies. On trouvera une revue sur ce sujet dans HJ Schüller; Current Genetics 43, n°3 (JUN03) 139-160.

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77. On trouvera dans H Fukuhara; FEMS Yeast Research 3 (JUN03) 327-331 une revue sur l'effet Kluyver chez les levures. Cet effet est la dépendance de l'utilisation de certains sucres (notamment les oligosaccharides) par rapport à la respiration, la fermentation étant bloquée en l'absence de respiration. L'utilisation fermentaire du glucose persiste en présence de cet effet. Il dépend des sucres et des levures. Saccharomyces cerevisiae, dont le mode de vie dominant est fermentaire ne présente pas cet effet pour la plupart des sucres qu'elle peut utiliser. Il est dû à l'incapacité des transporteurs de ces sucres à satisfaire au haut débit indispensable à la fermentation (on ne récupère qu'une faible partie de l'énergie potentielle de ces substrats puisqu'on se sert d'une partie de la molécule pour récupérer les électrons au lieu de l'oxyder). Il faut cependant se souvenir que S.cerevisiae peut fermenter des sucres sans donner lieu à une croissance, alors que d'autres levures doivent manifester une croissance notable pour fermenter des sucres. Ce genre d'observations rend plus difficile la définition de l'effet Kluyver.

La revue discute si cette observation faite chez Kluyveromyces lactis est généralisable. Le clonage, ces derniers temps de nombreux transporteurs devrait faciliter les choses.

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78. Les chercheurs du Nestlé Research Center avaient récemment identifié des protéines de surface des Lactobacillus johnsonii et Lactobacillus gasseri codées par deux gènes, apf1 et apf2, codant des constituants de la couche S périphérique et dénommées Aggregation-Promoting Factor. M Ventura et al.; Applied & Environmental Microbiology 68 (DEC02) 6172-6181. Ces protéines sont impliquées dans la conjugaison et l'auto-agrégation de Lactobacillus gasseri 4B2. Ces deux gènes sont indispensables, car il est impossible d'obtenir une inactivation des deux sans létalité. Par contre, la surexpression entraîne une modification de la forme cellulaire qui donne des cellules polymorphes en chaînes inextricables. I Jankovic et al.; Journal of Bacteriology 185, n°11 (JUN03) 3288-3296. Les auteurs ont réussi à déprimer la production en jouant sur le promoteur d'apf2. On obtient, alors, une filamentation sans cloisonnement, mais sans effet clair sur le phénotype d'agrégation.

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79.### AL de Boer et al.; Current Opinion in Chemical Biology 7 (APR03) 273-278, discutent des efforts réalisés pour inciter des cellules microbiennes à produire de nouveaux composés chimiques. Beaucoup de métabolites secondaires ont une structure modulaire, mais seule une petite fraction des structures potentielles a pu être révélée. La production de nouveaux composés non naturels est possible par les techniques de la génétique moléculaire éventuellement complétée par les dérivatisations chimiques.

La revue discute des approches récentes avec les synthèses combinatoires associant les gènes de plusieurs voies de synthèse, la combinaison de plusieurs domaines d'enzymes différentes (éventuellement modifiées par évolution dirigée) créant de nouvelles structure enzymatiques.

La production d'une nouvelle structure moléculaire au sein d'une famille suppose que la voie de production des précurseurs soit bien alimentée. Deux classes d'organismes existent de ce point de vue.

La première peut être représentée par les Streptomycètes qui possèdent des voies homologues de synthèses des polycétides. Si l'organisme est transformable, on peut facilement introduire des modifications dans cette voie pour obtenir le composé souhaité.

La seconde est celle où l'on introduit la voie de synthèse des précurseurs pour alimenter la production dans un hôte plus maniable. On a, ainsi, combiné les gènes de plusieurs organismes produisant des caroténoïdes dans une Escherichia coli naturellement non caroténogénique.

La production de beaucoup de métabolites secondaires dépend d'opérons, ce qui facilite le clonage et le transfert. Mais pour beaucoup de raisons, dont le criblage des producteurs puis leur utilisation, il faut obtenir une production très forte. Ceci suppose déjà une dose d'ingéniérie métabolique.

L'ingéniérie des caroténoïdes est facilitée par la nature colorée du produit qui facilite le criblage ses transformants et l'identification du produit. La revue discute des modifications auxquelles les auteurs ont participé.

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80. Des chercheurs de l'IFREMER ont isolé un microorganisme sécrétant un polysaccharide très visqueux. C'est un Alteromonas macleodii subsp. fijiensis biovar. medioatlantica isolé d'une crevette d'un fumeur hydrothermal profond de la crête océanique médioatlantique. Des Alteromonas ayant des propriétés similaires ont déjà été décrits

Le polysaccharide comporte des sous-unités glucose, galactose, et acides glucuronique et galacturonique substitués par des pyruvate et acétate. G Raguénès et al.; Current Microbiology 46, n°6 (2003) 448-452.

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81. Des chercheurs d'Utrecht, du TNO néerlandais et d'Unilever ont produit la peroxydase d'Arthromyces ramosus dans Aspergillus awamori, beaucoup mieux connu pour des productions industrielles. BC Lokman et al.; Journal of Biotechnology 103 (26 JUN03) 183-190.

La peroxydase d'A.ramosus est envisagée pour le blanchiment de la pâte à papier depuis 1990. C'est une enzyme glycoprotéique monomérique de 41 kDa. Elle comporte un protohème IX et montre une spécificité très large pour les donneurs de protons phénoliques et aniliniques. Il faut cependant en obtenir une production économiquement viable. Les Aspergillus sont tout indiqués, mais on ne possède que peu de données publiques sur la production de protéines à hèmes dans ces organismes et on sait que la production du noyau hème est limitante. Il semble qu'A.awamori soit capable de régler ce problème.

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82. Le numéro de Juin de Currrent Opinion in Microbiology est un pot-pourri de revues sur l'utilisation des microbes dans l'environnement et dans l'industrie. Quelques unes de ces revues seront examinées plus en détail dans ce numéro et dans ceux d'Août et Septembre.

Quatre des revues portent sur des outils potentiels fournis par les microbes et quatre autres sur des produits microbiens importants.

S Belkin; Currrent Opinion in Microbiology 6 (JUN03) 206-212 décrit des capteurs cellulaires bioluminescents et fluorescents permettant de détecter spécifiquement des polluants environnementaux, ainsi que d'autres molécules. Beaucoup de ces systèmes utilisent la dépression de la fluorescence en présence d'un polluant lésant la cellule. On utilise maintenant des systèmes basés sur les gènes de stress où on utilise les promoteurs de ces gènes commandant un gène reporteur. Il existe plusieurs fioritures sur ces reporteurs. On peut, d'ailleurs, faire reconnaître deux polluants différents avec des reporteurs fluorescents à des longueurs d'ondes différentes. Il existe également des microréseaux avec jusqu'à 700 souches recombinantes différentes reconnaissant autant de molécules (l'analyse est un peu plus développée au §118).

B Van den Burg; p.213-218 font le point sur les enzymes d'extrêmophiles (tolérant chaleur, salinité ou acidité). Le postulat est que les enzymes issues de ces organismes doivent tolérer ces sévices, ce qui n'est pas évident car la bactérie sait s'isoler du milieu, ou compense les lésions par un turn-over très rapide des protéines lésées. L'auteur discute des enzymes des thermophiles, halophiles, psychrophiles, alcaliphiles, acidophiles, piézophiles etc…. Pour l'instant on exprime les gènes potentiels dans Escherichia coli pour des raisons de commodité.

D Shallom et al.; p.219-228 se concentrent sur les hémicellulases. Ces enzymes sont extra-cellulaire par essence. Les hémicellulases contiennent des modules de fixation et des modules catalytiques. Ces deux fonctions sont assurées de façons différentes. Les auteurs décrivent les interactions entre ces enzymes et leurs substrats.

KA Gray et al.; p.229-235 décrivent les techniques de désulfuration des carburants fossiles et plus particulièrement des dibenzothiophènes par Rhodococcus erythropolis IGTS8 (alias R.rhodochrous).

Quatre enzymes sont nécessaires dont deux monooxygénases et une flavine réductase puis une désulfinase donnant, comme produit final, du 2-hydroxybiphényl et du sulfate. C'est la réductase qui est généralement limitante.

Des Paenibacillus sp. et Mycobacterium phlei thermophiles ont été essayés dans ce domaine à haute température. Pour l'instant l'activité catalytique est trop limitée, ce qui avait encouragé Enchira Biotechnologies à se lancer dans l'amélioration dirigée de ces enzymes (et à promouvoir la commercialisation des intermédiaires).On trouvera une analyse un peu plus complète au § pour la technique et au § pour les péripéties juridiques.

Y Shimizu; p.236-243 discute les avancées dans le domaine de la production de métabolites des microalgues. L'auteur traite surtout de la cyanobactérie tropicale Lyngbya majuscula productrice de nombreuses substances actives et notamment toxiques et ressemblant en cela aux Streptomycètes. La toxinogénicité des dinoflagellés comme Pfiesteria est encore en discussion car cette microalgue ne possède pas de polycétide synthase source des toxines.

T Ishige et al.; p.244-250 s'intéressent aux cires produites par des bactéries à partir d'alcanes et de produits d'oxydation des alcanes. L'estérification d'alcanols et d'acides alcanoïques permet d'obtenir des chaînes alkyls à moyennes et longues chaînes estérifient des acides alcanoïques de C14 à C22. Cette production est très similaire à celle des polyhydroxyalcanoates (PHAs) pour lesquels JM Luengo et al.; p.251-260 font le point sur l'état des lieux pour ces biopolymères et d'autres bioplastiques. Ces polymères sont construits à partir d'hydroxyacyl-CoA via différentes voies métaboliques.

Le talon d'Achille de ces productions (triple talon dans ce cas) est leur coût prohibitif dû à des conditions défavorables de production, au coût des substrats et à la difficulté de récupération. Le polymère s'accumule comme réserve carbonée quand d'autres carences comme celle en azote se manifestent. Du coup la prolifération est sérieusement ralentie. Les substrats utilisables sont encore coûteux, le glucose est exclu de ce fait. On peut tourner la difficulté en les faisant produire dans des graines. Reste alors la récupération qui est encore très difficile, voir les brevets qui se dénigrent mutuellement. C'est la raison pour laquelle ICI qui a commencé une production microbienne en 1982 a jeté l'éponge et a vendu la filière à Monsanto qui s'en est ensuite débarrassée en faveur de Metabolix qui publie en rafale des brevets sur tous ces points

Il faut se rappeler que c'est un français, M Lemoigne, qui a décrit pour la première fois, en 1926 dans le Bulletin de la Société de Chimie Biologique, le poly(3-hydroxybutyrate) (PHB) chez Bacillus megaterium. Observation complètement oubliée jusqu'à sa résurrection en 1974. Depuis les PHAs ont fait bien du chemin, avec plus de 90 genres de microorganismes capables de les synthétiser identifiés. L'étude de ces synthèses a surtout été réalisée chez Alcaligenes eutrophus devenu, avec la gloire, Ralstonia eutropha, divers Pseudomonas dont in Pseudomonas oleovorans et P.putida.

A Steinbüchel; p.261-270 discute le potentiel de bioproduction de substituts de caoutchouc par des microroganismes, mais on ne connaît pas beaucoup de bactéries qui en sont capables. La revue compare de ces produits avec le cis-1,4-polyisoprène de l'hévéa qu'on produit actuellement à raison de 7 millions de tonnes par an, ce qui correspond à 40% du caoutchouc utilisé, le reste étant produit par synthèse artificielle (caoutchouc synthétique) qui ne reproduit pas toutes les propriétés des caoutchoucs naturels, ce qui explique que le rapport n'ait guère varié au cours des trente dernières années. La seule autre source de caoutchouc naturel, en dehors de l'hévéa, qui continue à régner en maître, est le guayule (Parthenium argentatum une composée), une plante semi-désertique qui a été utilisée pendant la seconde guerre mondiale quand les japonais se sont emparé du Sud-Est asiatique et de ses plantations d'hévéas. Il existe pourtant 2500 plantes produisant des caoutchoucs.

La revue discute des propriétés des élastomères à élasticité entropique et des caoutchoucs viscoélastiques. Les seuls biopolymères naturels qui se rapprochent des caoutchoucs naturels sont les PHAs à chaînes moyennes.

L'idée de cloner et exprimer des synthases végétales dans des bactériese n'est pas simple à réaliser. La revue essaye d'analyser les difficultés qui pourrait être rencontrées en se basant sur ce que l'on sait des polyoxoesters et polythioesters.

Il faudrait d'abord produire la partie isoprène par la voie du mévalonate et du méthylérythritol phosphate puis assurer la polymérisation de l'isoprène via une prényltransférase. Encore faudrait-il disposer de gènes de prényltransférases qui ne sont pas encore connus.

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83. Une souche de levure capable de produire de l'éthanol à partir de xylose serait la bienvenue, car elle augmenterait la rentabilité commerciale du bioéthanol en partant de substrats meilleurs marché que les substrats usuels. Saccharomyces cerevisiae n'est pas capable d'utiliser ce pentose issu des hémicelluloses. Des chercheurs suédois et sud-africains ont obtenu une souche (TMB 3400) de S.cerevisiae capable d'utiliser le xylose par incorporation des gènes de D-xylose réductase (qui donne du xylitol), xylitol déshydrogénase qui convertit le xylitol en xylulose) et xylulokinase (conversion du xylulose en xylulose 5-phosphate), puis mutagenèse au hasard et sélection pour la croissance sur xylose. En effet des souches transformées antérieures, comme E.coli TMB 3001, où les gènes permettaient bien la production d'éthanol à partir du xylose, mais pas une croissance anaérobie sur ce pentose. La surexpression de la xylulose kinase est nécessaire. Les gènes utilisés pour la transformation sont ceux de Pichia stipitis. La croissance et la production d'éthanol n'atteignent cependant pas celle de Pichia stipitis CBS 6054, la meilleure utilisatrice connue du xylose. CF Wahlbom et al.; FEMS Yeast Research 3 (MAY03) 319-326. S.cerevisiae possède cependant déjà une faible activité D-xylose réductase et xylitol déshydrogénase.

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84.### Gary Strobel a publié une revue sur l'utilisation des endophytes pour la production de produits bioactifs. GA Strobel; Microbes & Infection 5 (MAY03) 535-544.

L'intérêt de cette étude est dans l'abord des recherches par une voie écologique, en analysant la biologie des plantes pour en déduire la présence probable et l'utilité des endophytes.

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