Parcours n°3 Génétique








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Parcours n°3 – Génétique
Cours n°15 Structure et organisation du chromosome partie2

29/02/2016

Pr JM Dupont
jean-michel.dupont@cch.aphp.fr



RT : Sam VAKILI

RL : Alexis Laudat





STRUCTURE DES CHROMOSOMES



  1. REORGANISATION DU GENOME PENDANT LA MITOSE - FORMATION DES CHROMOSOMES MITOTIQUES



  2. LES PROTEINES ASSOCIEES A LA REORGANISATION DU GENOME

  1. Les condensines

  2. Les cohésines

  3. La topoisomérase




  1. MOUVEMENTS DES CHROMOSOMES PENDANT LA COMPACTION




  1. DYNAMIQUE CHROMATINIENNE PENDANT L’INTERPHASE ?

1. L’extinction de fluorescence par laser

2. Mouvements chromatiniens à différentes phases

3. Mouvements chromatiniens pendant la réparation d’ADN


  1. MOBILITÉ DE LA CHROMATINE D’UNE CYCLE CELLULAIRE À L’AUTRE

  1. Conservation de l’arrangement global d’un cycle à l’autre

  2. Évolution des positions respectives des chromosomes

  3. Réorganisation dynamique pendant la différenciation




Mot du RT deuxième partie : Cours non relu par le prof par manque de temps, relativement abordable avec tout plein d’images, bon courage !

I. REORGANISATION DU GENOME PENDANT LA MITOSE
- FORMATION DES CHROMOSOMES MITOTIQUES


La division est une fonctionnalité du génome : assurer une répartition équitable et homogène du patrimoine génétique répliqué dans les cellules filles. Cela implique une réorganisation du génome. Pour la séparation physique, la cytodiérèse, il faut compacter les molécules d’ADN.

Les transformations morphologiques sont très importantes, et vont donner naissance transitoirement aux chromosomes. L’aspect transitoire est très important.
En prophase, il y a dispersion des molécules d’ADN et des protéines nécessaires. Le déclenchement de la prophase entraîne l’association de ces protéines avec l’ADN. Elles s’associent d’abord en périphérie de la chromatine de chaque molécule. Puis avec le remaniement de la chromatine, elles vont au final constituer un axe central. C’est une reconformation permanente de la chromatine. Cet axe central du chromosome n’est pas figé il est dynamique, les protéines de l’axe sont continuellement remplacées. (cf ci dessous)



En métaphase, le chromosome est constitué de l’axe protéique central autour duquel s’organisent les boucles d’ADN. Si on marque les protéines de l’axe, on observe que le marquage reste dans l’axe quelques minutes, puis sort. C’est bien un assemblage dynamique. (cf ci dessous)

Qu’est ce qui conduit la réorganisation du génome? La physiologie de la génétique est encore très mal connue. On ne sait pas très bien exactement comment est assemblé l’ADN dans les chromosomes. On n’a pas encore tous les outils pour observer les étapes d’assemblage.

L’élément déclencheur de cette réorganisation en mitose sont des modifications physico-chimiques. L’ADN est chargée négativement, et les histones positivement. Leur charge peut être modulée. Cette modulation permet de moduler la compaction de la chromatine. Il y a ainsi des modifications d’attraction de certaines régions par ces forces électrostatiques. C’est le point de départ.



  1. LES PROTEINES ASSOCIÉES A LA RÉORGANISATION DU GENOME

A- Les condensines

Il s’agit d’un complexe protéique qui est présent au niveau de l’axe chromatinien (tout au long du chromosome). Ces différentes protéines forment un complexe en forme de V. Les 2 protéines principales : SMC-2 et 3 (Structural Maintenance of Chromosome) vont former cette structure qui va être fermée à son extrémité par des Kléisines et des motifs HEAT (protéines non SMC). Ces protéines non SMC vont avoir la propriété de s’ouvrir et se fermer pour laisser le passage ou pas à l’intérieur du V. Cette ouverture/fermeture va consommer de l’ATP.



Il s’agit d’une pince qui va pouvoir attraper des boucles d’ADN pour les maintenir ensemble. Au final le rôle des condensines est le contraire de celui de la topo isomérase, ils créent et stabilisent des super tours, des boucles d’ADN.
Il existe 2 sous types de condensines, ils n’interviennent pas au même moment du cycle.

Elles vont se situer tout le long de l’axe chromatinien, mais pas dans la même proportion.

Au niveau du centromère on a une prépondérance de condensines 2.
La condensine 2, est présente dans le noyau, elle peut donc avoir un rôle dès le début de la prophase. Alors que la condensine 1 est initialement cytoplasmique, elle ne va pouvoir agir que secondairement, une fois que la membrane nucléaire a disparu.
A l’initial on pensait que la condensine était la protéine qui permettait de condenser l’ADN et d’aboutir à un chromosome au stade métaphasique. PROBLÈME : chez des souris KO pour une des protéines de la condensine, il y avait toujours compaction de la chromatine.

=>En l’absence de condensine, on a une compaction de la chromatine, mais elle est retardée et se fait de manière anarchique. Elle n’est pas indispensable au processus de condensation. (Le moteur de la condensation est intrinsèquement lié a l’architecture de la chromatine elle même et ses propriétés physico-chimique).
La condensation est possible mais l’axe protéique est peu présent et en l’absence d’axe protéique, les chromosomes ne vont pas s’agréger naturellement et on a défaut de séparation des chromosomes à l’anaphase.
Les condensines permettent la localisation d’un certains nombres de protéines (topo 2), elles participent au squelette et sont indispensables à la mise en place des autres composants du squelette. L’absence du squelette protéique va entrainer une fragilité du chromosome qui va entrainer une élongation anormale par les fuseaux de division et une perte de matériel génétique.


B- Les cohésines

Elles ont une structure extrêmement proche de celles des condensines. Il s’agit d’une pince capable d’attraper des molécules d’ADN.
Les condensines permettent d’associer des boucles d’une même chromatine, les cohésines permettent d’associer des boucles de 2 chromatides sœurs.

=>Les cohésines permettent de maintenir associées les 2 chromatides sœurs après la réplication. Mais on sait qu’actuellement elles ont un rôle au sein d’une même
chromatide.


Il existe plusieurs modèles de pince de cohésines.
-Le modèle A : les 2 chromatides sœurs sont dans un anneau de cohésines. Semble peu probable. On n’a pas la place dans un anneau de cohésines de faire passer 2 fibres de chromatides.

-Il semble plus probable que chaque cohésine soit enroulée autour d’une chromatide et c’est l’association des 2 cohésines qui permet l’association des 2 chromatides.
Les cohésines ne vont se charger sur la chromatide qu’à un seul moment du cycle cellulaire : en début de phase G1. Elles vont s’ouvrir pour laisser passer la fourche de réplication au moment de la phase S. Elles vont ensuite maintenir entre elle les 2 chromatides sœurs et elles ne vont être libérées qu’au moment de la division cellulaire.
La séparation des cohésines se fait en 2 temps :
-Au niveau des bras chromosomiques la séparation des chromatides sœurs se fait au fur et à mesure de la compaction du chromosome. Au fur et a mesure que la chromatine se condense pour aboutir à la formation de la chromatide, les cohésines vont être éliminées.

-Les cohésines qui se maintiennent le plus longtemps sont les cohésines centromériques. Ces dernières ne vont être dégradées par la séparasse qu’au moment de l’anaphase (check-point mitotique).




C. La topoisomérase



Parmi les protéines importantes pour cette réorganisation, on trouve la topoisomérase, présente tout le long de l’axe central. Seule l’isoforme alpha nous intéresse ici en métaphase. Elle a le rôle de casser et recoller l’ADN. C’est la décaténation, elle supprime les noeuds d’ADN qui peuvent survenir. Elle aide ainsi la séparation des chromatides soeurs.

Son rôle enzymatique consomme de l’ATP, et elle n’est pas fixée de manière définitive au chromosome. Il y a un flux constant de protéines.
Si on n’a pas de topoisomérase, le chromosome aura une morphologie anormale, et il y aura un défaut de ségrégation.

Cf image ci dessous: les bras anormalement allongés, et on observe une persistance de chromatine au milieu avec risque de perte de matériel génétique. La topoisomérase est une protéine indispensable.





III. MOUVEMENTS DES CHROMOSOMES PENDANT LA COMPACTION

Notre génome ne se réplique pas tout d’un coup, mais à partir d’origine de réplication au niveau desquelles la fourche de réplication démarre et se fait de manière coordonnée. On peut suivre ces spots de réplication grâce à des techniques de fluorescence.

=>On est capable de suivre dans une cellule vivante la progression de la réplication.
On peut arriver à suivre le mouvement de ces spots de réplication tout au long de la phase S, puis la phase G2. On s’aperçoit que chaque spot marqué bouge assez peu. La réduction de taille est à peine de 10%. (Correspondant au réarrangement global de la molécule).
Pendant la prophase, il n’y pas de réduction de taille, mais il y a réorganisation de la taille de la molécule d’ADN qui a pour principal objectif d’augmenter le diamètres des chromatides.

=>Le but essentiel de la prophase est de séparer correctement les 2 chromatides sœurs pour ne pas avoir d’emmêlement au moment de l’anaphase.
L’ensemble des complexes et protéines permettant cette condensation a une action enzymatique, elles ne sont donc pas fixées au chromosome, elles ne font « que passer ».





IV. DYNAMIQUE CHROMATINIENNE PENDANT L’INTERPHASE ?
Est-ce possible qu’un sous-territoire, des fragments de chromatine bougent pendant l’interphase dans le noyau?
1. L’extinction de fluorescence par laser
Pour répondre on utilise la technique d’extinction de fluorescence par laser. Elle consiste en l’irradiation d’une cellule fluorescente, qui contient une histone marquée à la GFP. L’ensemble de la chromatine est fluorescent, et si on irradie par laser une partie de cette chromatine, la fluorescence s’éteint (car l’émission des photons ne s’émet qu’une fois, contrairement à la phosphorescence, qui peut émettre les photons plusieurs fois).

Cela permet de générer des cellules avec seulement certaines régions chromosomiques qui sont fluorescentes, et on peut ainsi étudier leur évolution pendant l’interphase. Ce qui est pratique c’est que l’on peut combiner plusieurs couleurs fluorescentes.
2. Mouvements chromatiniens à différentes phases
Au départ on fait des études grossières : on éteint la moitié de la cellule. On observe alors que jusqu’à la mitose, il n’y a pas de modification de la répartition de la chromatine. Ainsi globalement pendant l’interphase il n’y a pas de mouvements chromatiniens, pas de réorganisation drastique. L’espace disponible pour ces mouvements n’est pas énorme en plus.


On peut être ensuite plus précis.

Exemple : ci-dessous, avec le laser on a fait un damier. On effectue l’observation jusqu’en phase G2, et globalement, l’image initiale du damier est conservée. Il y a des petits mouvements, qui entraînent un petit flou après quelques heures. On peut les suivre, ils sont associés à des phénomènes, comme notamment la différenciation cellulaire. Gènes éteints et gènes activés.

Exemple : On étudie ci-dessous les gènes Hoxb1 et Hoxb9. Au début de l’expérience ils sont en plein milieu du TC, endroit peu accessible. Puis au fur et à mesure de la différenciation de la cellule, ils se déplacent en périphérie du TC. Il y a ainsi “externalisation” du gène par rapport au TC, et exposition à la machinerie transcriptionnelle. Cette externalisation correspond à la décompaction de la boucle d’ADN qui porte le gène. On a donc observé ici la réorganisation d’une boucle d’ADN.



Exemple : On étudie ici des gènes présents sur le chromosome 1 dans des kératinocytes. C’est le même principe : les gènes au centre bougent en périph au début de la différenciation.

Quand un gène va être activé, il est ainsi, dans la mesure du possible, externalisé. Car c’est là qu’il y a la meilleure accessibilité et efficacité de transcription. Mais il y a quand même une certaine accessibilité au centre du TC. En effet, tous les gènes ne peuvent pas être en périphérie.

Certains gènes peuvent être inactivés par relocalisation et association avec une région chromatinienne inactive : notamment les régions d’hétérochromatine, comme les centromères. Il n’y a pas du tout d’accessibilité pour les facteurs de transcription.
3. Mouvements chromatiniens pendant la réparation d’ADN
Comme le montre la diapo ci-dessous on irradie une cellule aux particules alpha, ce qui génère des cassures d’ADN. On marque ensuite l’histone h2ax, qui est impliquée dans le mécanisme de réparation.

Pendant la phase G1 il y a une concentration et association des cassures au sein des complexes enzymatiques qui vont permettre la réparation. Cela permet d’optimiser le mécanisme.

Pendant la phase G2, une chromatide sœur est utilisée pour servir de modèle. La machinerie copie le bras homologue, il y a donc un petit déplacement dans le noyau pour rechercher la chromatide sœur.

Il n’y a donc pas de mouvements importants, mais de petits mouvements dans le voisinage, il y a une certaine dynamique. La chromatine a la capacité de se réorganiser en sous domaines qui sont plus ou moins relaxés, et permettent plus ou moins le passage d’enzymes.


On a également compris que les enzymes ne ciblent pas les gènes un à un dans le noyau, mais qu’il y a plutôt concentration de toute la machinerie dans une région, et relocalisation des gènes cibles dans cette région.

En conséquence, on peut rassembler dans la même zone transcriptionnelle ou de réparation des boucles d’ADN provenant du même chromosome, voire d’un chromosome voisin. Cette proximité peut avoir pour conséquence une facilitation des anomalies chromosomiques.



  1. MOBILITÉ DE LA CHROMATINE D’UN CYCLE CELLULAIRE À L’AUTRE




  1. Conservation de l’arrangement global d’un cycle à l’autre



D’un cycle cellulaire à l’autre on retrouve la même organisation qu’avait la cellule mère.

=>Il existe un mécanisme épi génétique qui permet de contrôler le moment précis de la division de chaque centromère pour que globalement les cellules filles retrouvent le même type d’organisation que la cellule mère.

Cependant à une échelle plus précise on se rend compte qu’il existe des petites différences d’organisation qui font que la cellule fille n’est pas un clone sur le plan fonctionnel de la cellule mère.
S’il y a une organisation si précise du génome c’est qu’il y a un intérêt fonctionnel. S’il y un rôle fonctionnel de l’organisation du génome pendant l’interphase on peut imaginer que de petites modifications à chaque cycle cellulaire peuvent entrainer des modifications fonctionnelles de la cellule fille ce qui fait que toutes les cellules ne vont pas avoir le même rôle ou les mêmes capacités de transcription.
Au cours d’un cycle cellulaire, la chromatine ne bouge pas beaucoup, au cours de la division cellulaire la chromatine se met à bouger et elle est réorganisée. Mais pourtant à la télophase suivante elle va reprendre la même organisation malgré quelques réorganisations aléatoires.

=>Il y a possibilité d’un cycle à un autre, de mobilité de la chromatine, d’un segment par rapport à un autre.
Ce mécanisme de réorganisation aléatoire pourrait participer à l’horloge biologique et au vieillissement de certaines cellules, on peut tout envisager.




  1. Évolution des positions respectives des chromosomes




  1. Réorganisation dynamique pendant la différenciation


Ces réorganisations du génome peuvent être beaucoup plus drastiques et participer à une différenciations cellulaire particulière.
Expérience qui étudie la réorganisation dynamique au cours des différentes divisions cellulaires de la chromatine dans les cellules des cônes et des bâtonnets :
Chez la souris on a 3 types de chromatine :

->L’euchromatine, qui est la partie codante

->L’hétérochromatine classique

->Une autre hétérochromatine particulière l’euchromocentre qui correspond à l’hétérochromatine centromérique. Elle a la particularité de s’assembler en segment extrêmement dense.


A gauche l’organisation normale d’un noyau de fibroblaste de la souris avec : l’hétérochromatine en périphérie (rouge) et l ‘euchromatine au centre (en vert) et l’euchromocentre (en bleu)
Ce que l’on a observé c’est que dans les cellules de la rétine, on assiste après la naissance à une réorganisation de cette chromatine surtout après l’ouverture des yeux donc acquisition fonctionnelle de la vision.

Cette réorganisation va aboutir à une inversion complète de l’organisation du génome avec l’euchromatine en périphérie et l’hétérochromatine complètement condensée au centre de la cellule. Associé a cette réorganisation on assiste à une réduction du niveau nucléaire et une réduction des chromocentres qui sont tous réunis en un seul.
Ils ont étudié plein d’espèces différentes, ce type de réorganisation spécifique des bâtonnets n’a été observé que chez les espèces nocturnes.
Classiquement on dit que l’hétérochromatine est en périphérie pour protéger l’euchromatine au maximum des irradiations ionisantes.

On pourrait alors penser que cette réorganisation est moins efficace sauf qu’il a pu être montré que cette condensation de l’hétérochromatine au centre de la cellule, cette réduction du volume nucléaire permet de limiter au maximum la diffraction des rayons lumineux qui viennent frapper la rétine. (10 couches à traverser dans la rétine avant d’arriver aux cônes et aux bâtonnes)

=>En diminuant le volume nucléaire de ces cellules, en concentrant l’hétérochromatine au centre on diminue la réfraction de la lumière et donc on augmente la quantité de photon captée par les photorécepteurs.
L’organisation même de la chromatine dans le noyau peut avoir un rôle fonctionnel au-delà de la simple transcription.
Le génome ne doit pas être vu comme une entité fixe, mais comme une structure dynamique aussi bien dans sa composante moléculaire d’interaction génique que dans sa composante cellulaire d’organisation au niveau nucléaire.
Il faut retenir la notion de mobilité : très faible pendant le cycle cellulaire, importante pendant la division et qui peut exister d’une division à l’autre.

FICHE RECAPITULATIVE

I. Réorganisation du genome pendant la mitose :
Les transformations morphologiques, qui sont conséquentes, aboutissent aux chromosomes. Cependant, il faut retenir que l’aspect transitoire est important.

Prophase : dispersion des molécules d’ADN et des protéines nécessaires.

Constitution d’un axe central : reconformation permanente de la chromatine. Cet axe n’est pas figé : il est dynamique. (remplacement continuel des protéines de l’axe).

II. Les protéines associées à la réorganisation du genome :

Condensines : Si absence de condensine, la compaction chromatinienne a quand même lieu mais est retardée et anarchique.

Elles ne sont pas indispensables au processus de condensation en lui-même (le moteur étant intrinsèque : lié à l’architecture + propriétés physico-chimiques chromatinienne).
Cohésines : Les cohésines ne vont se charger sur la chromatide qu’à un seul moment du cycle : en début de phase G1. Libération des cohésines qu’au moment de la division cellulaire.
Topoisomérases : Indispensables à la morphologie du chromosome et à la ségrégation.


III. Mouvements des chromosomes pendant la compaction :

Cf notion d’origine de réplications : spots de réplications mobiles, débutant à un endroit donné.
Prophase : son but essentiel est la séparation harmonieuse des 2 chromatides sœurs pour ne pas avoir d’anomalies au moment de l’anaphase.
L’ensemble des complexes et protéines permettant cette condensation a une action enzymatique, elles ne sont donc pas fixées aux chromosomes, elles ne font « que passer ».

IV. Dynamique chromatinienne pendant l’interphase :

Jusqu’à la mitose, il n’y a pas de modification de la répartition de la chromatine. Ainsi globalement pendant l’interphase il n’y a pas de mouvements chromatiniens, pas de réorganisation drastique.
Notion d’externalisation d’un gène : meilleure accessibilité et efficacité de transcription.

Notion d’inactivation d’un gène : par relocalisation et association à une région chromatinienne inactive (hétérochromatine). Aucune accessibilité pour les FT.

Histone H2AX : impliquée dans les mécanismes de réparation de l’ADN.

Il n’y a pas de mouvements importants, mais de petits mouvements dans le voisinage : dynamisme. La chromatine a la capacité de se réorganiser en sous domaines qui sont plus ou moins relaxés, et permettent plus ou moins le passage d’enzymes.
Enzymes ciblent des concentrations de gènes, préalablement relocalisés si gènes cibles au sein de cette concentration.

Cette proximité peut entrainer des anomalies chromosomiques par facilitation.

V. Mobilité de la chromatine d’un cycle cellulaire à un autre :

Mécanisme épi-génétique permettant de controler le moment précis de la division de chaque centromère pour que les cellules filles retrouvent la même organisation que la cellule mère.
Cependant, il existe de petites différences d’organisation : la cellule fille n’est pas un clone sur le plan fonctionnel.
Il y a possibilité d’un cycle à un autre, de mobilité de la chromatine, d’un segment par rapport à un autre. Ce mécanisme de réorganisation aléatoire pourrait participer à l’horloge biologique et au vieillissement de certaines cellules.
Réorganisations dynamiques pendant la différenciation : peuvent être beaucoup plus drastiques.
L’organisation même de la chromatine dans le noyau peut avoir un rôle fonctionnel au-delà de la simple transcription.
Le génome ne doit pas être vu comme une entité fixe, mais comme une structure dynamique aussi bien dans sa composante moléculaire d’interaction génique que dans sa composante cellulaire d’organisation au niveau nucléaire.
Il faut retenir la notion de mobilité : très faible pendant le cycle cellulaire, importante pendant la division et qui peut exister d’une division à l’autre.



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